mGM-CSF重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其基因治療腫瘤的初步研究

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1、中文摘要mGM—CSF重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其基因治療腫瘤的初步研究研究生洪曉武導(dǎo)師竇駿(教授)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中義摘要腫瘤是全球最普遍而導(dǎo)!致死亡的主要疾病之，雖然近年來腫瘤的治療水平有所提高，但死亡率還是居高不下。目前腫瘤的治療方案主要有手術(shù)、放療和化療，這些方法t一期都有一定的療效，但其副作用嚴(yán)重影響患者的H常生活，而且許多癌癥復(fù)發(fā)率很高，大部分病人因為癌癥復(fù)發(fā)麗死亡。近年用細(xì)胞因子基因免疫配合傳統(tǒng)方法，克服了上述不足，為治療腫瘤提供了新的思路。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激凼子(GranulocytemacrophagecolonystimUlatingfactor，(；M

2、—CSF)是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，豐要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞J“：生，通過旁分泌和自分泌作用于Dc細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，可以促進(jìn)Dc等APC分化、成熟和活化及上調(diào)CD86的表達(dá)以激發(fā)對腫瘤的免疫應(yīng)答；增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和ADCC效應(yīng)等活性；促進(jìn)Th、TC、NK在腫瘤部位浸潤，從而殺傷月1t瘤。本實驗成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3．1／mGMCSF／Myc一1liS()(A)(簡稱為pcmGMCSF)，建直了HeN動物模型，然后基闋免疫小鼠，觀察GM—CSF的治療效果，為腫瘤的治療提供一種新的思路和

3、方法。本實驗分為兩個部分：一、重組質(zhì)粒pc—mGM-CSF的構(gòu)建、表達(dá)和活性鑒定Ft的構(gòu)建pcmGMCSF重組質(zhì)粒載體，為研究GM—CSF治療腫痛奠定基礎(chǔ)。力‘法通過RTPCR從Ba]b／c小鼠脾臟巾獲得mGM—CSF基因，克隆于p(：DNA3．】／MycHiS()(A)質(zhì)粒上，用PCR、酶切及基因測序方法分別鑒定pcmGMCSI?，然后用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染小鼠骨’髓瘤細(xì)胞SP2／O，用G418篩選后通過RT—PeR和SDSPAGE鑒定mGMCSF表達(dá)，將轉(zhuǎn)染SP2／O的上清加入mGM—CSF依賴株NFS60細(xì)胞，檢測蛋白活性。結(jié)果重組質(zhì)粒中含有mGM—CSE基因，在S

4、I，2／0中能表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物能分泌到細(xì)胞外并具有生物學(xué)活性。結(jié)論本實驗成功構(gòu)建含mGMcsF真核表達(dá)重組質(zhì)粒，有助于進(jìn)一步研究其協(xié)同抗腫瘤作用。二、mGM—CSF基因免疫誘發(fā)小鼠協(xié)同抗腫瘤作用目的通過mGMCSF基因免疫小鼠以誘發(fā)小鼠對HeN的免疫應(yīng)答，為GM—CSF拱因治療腫瘤打下基礎(chǔ)。方法用SP2／O腫瘤細(xì)胞皮下接利tBa]b／c小鼠建0：腫瘤動物模型，再以皮下或肌肉注射空質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒，8w后觀察致瘤率、腫瘤重量、腫瘤組織淋巴細(xì)胞的浸潤情況、檢測血清中IFNv和lL-2濃度以及MTT法體外檢測c，II。、NK細(xì)胞活性。結(jié)果基因免疫galb／c小鼠8w后，重

5、組質(zhì)粒皮東南人學(xué)碩士學(xué)位論文卜．注射組腫瘤重量(o．880_+0．4059)輕于對照組(1．548+0．22lg)(p

6、；(jM—CSF基因免疫為治療腫瘤提供一種新的思路。關(guān)鍵詞粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；基因免疫；基因治療；抗腫瘤IIAbstraclTHECONSTRUCTl0N0FRECOMBIANTPLASMIDWITHmGM—CSFANDITSANTITUMOREFFECTSPostgraduate：HONGXiao—Wtl7Futor：Prot、essorDOUJunMedicalSchoolofSoutheastUniversityABSTRACT’Fumorisoneofthemostcommonworldwidediseasesandresponsibleforthe

7、majorityofdeaths．Inspiteofimprovementofthemerapy．themortalityoftumordoesnotdecrease．Althoughconventionalstrategies(surgery,chemotherapy,andradiotherapy)produceahighrateofcureforpatientswithearly-stagedisease，manyserioussideeffectsareoftenIeftandinterferewithpatients’dailylivesFurther