異丁醇細胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化

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1、密級：中國科學(xué)院大學(xué)UniversityofChineseAcademyofSciences博士學(xué)位論文培養(yǎng)單位：二零一三年四月MetabolicEngineeringofEscherichiaColiforIsobutanolProductionByAiqinShiADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofMicrobiologyTianjin

2、InstituteofIndustrialBiotechnology，ChineseAcademyofSciencesApril，2013獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨立進行研究工作所取得的研究成果。除文中已經(jīng)標明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標明。本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。作者簽名：名磕琴日期：矽序年r月l7日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解蟲冒型堂睦云望王!蛙塹堇盎疊塞壓有關(guān)保留、使用學(xué)位論

3、文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)蟲國科堂院云望』些生塹撞苤硒塞所可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。同意中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。作者簽名：屆愛鴦導(dǎo)師簽名：弘寫砜．／日期：功f芎年r月一日日期：ⅪJ虧年3月‘／日j

4、致謝三年的博士生學(xué)習生活即將結(jié)束。回首這短暫的求學(xué)經(jīng)歷，感慨頗多。在這三年中，很多老師、同學(xué)和朋友在各方面給予了我大力

5、的支持和幫助，值此論文完成之際，謹向他們表示最誠摯的謝意。首先，本論文是在導(dǎo)師張學(xué)禮研究員的悉心指導(dǎo)下完成的。張老師淵博的學(xué)識、活躍的思維、嚴謹?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、循循善誘的教導(dǎo)使我終生受益；他給我提供了寶貴的學(xué)習機會，讓我度過了美好而充實的研究生生活，值此論文完成之際，謹在此表達我最誠摯的感謝和敬意!在三年的研究生生活中，有幸在中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所學(xué)習，衷心感謝研究所的領(lǐng)導(dǎo)和各位老師對我的栽培和厚愛。本文是在張學(xué)禮老師領(lǐng)導(dǎo)的微生物代謝工程實驗室完成的，特別感謝陳卓、朱欣娜、徐洪濤、戴住波、李清艷和劉萍萍對本實驗論文的耐心指導(dǎo)和深切

6、關(guān)注!感謝我的室友蔡鵬麗，還有一起工作學(xué)習過的同學(xué)韓麗、高秀珍和李廣悅，在我生活和工作上的幫助和支持。感謝我可愛的師弟師妹們，他們是譚在高、劉怡、趙婧、唐金磊、許驕陽、肖夢雍、陳晶、戴冠平、王貝貝、王曉芳、施明雨、孫濤、李陽和劉蕓，是他們共同營造了愉快的學(xué)習氛圍和進取的工作氣息伴隨我度過了美好的研究生生活。感謝我的家人，他們共同分享了我的快樂和痛苦，一直默默地幫助、支持和鼓勵我，使我有決心和信心完成學(xué)業(yè)。大家的幫助使我順利完成了論文，在此表示衷心感謝!石愛琴2013年4月摘要隨著環(huán)境污染不斷加重以及能源供求之間的矛盾日益尖銳，尋找石化燃

7、料的可替代生物能源越來越受到人們的關(guān)注。異丁醇由于具有能量密度接近于汽油：氣壓低，容易與汽油混合；與乙醇相比，可以和汽油高比例混合，而不需要特殊的適應(yīng)裝置等優(yōu)勢而受到人們的青睞。利用支鏈氨基酸合成途徑和Ehrlich途徑已經(jīng)在幾種生物中實現(xiàn)了異丁醇的生物合成。本研究將異丁醇合成途徑中的五個關(guān)鍵基因(alsS，ilvC，ilvD，kivD及adhA)整合到大腸桿菌XZ—T010基因組上，并利用本實驗室構(gòu)建的人工調(diào)控元件對其表達進行優(yōu)化，獲得一個性能較好的異丁醇生產(chǎn)茵ASl08，好氧發(fā)酵24小時生產(chǎn)l14mM異丁醇，糖醇轉(zhuǎn)化率為O．51mo

8、l／mol，厭氧發(fā)酵6天生產(chǎn)35mM異丁醇，糖醇轉(zhuǎn)化率為0．66mol／mol。之后采用RBS文庫在菌株ASl08中對異丁醇生物合成基因進行調(diào)控并進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)對醇脫氫酶AdhP進行調(diào)控優(yōu)化后，異丁醇產(chǎn)量提高了20％，轉(zhuǎn)化率提高了9％，醇脫氫酶的酶活提高了18％。異丁醇生物合成過程中需要還原性輔因子NADPH，而厭氧條件下，糖醇解過程中主要生產(chǎn)NADH。本研究采用三種不同的策略來優(yōu)化胞內(nèi)輔因子供求之間的平衡以滿足異丁醇生產(chǎn)的需要。第一種策略是通過激活轉(zhuǎn)氫酶和NAD激酶，加速NADH和NADPH之間的轉(zhuǎn)換。在厭氧發(fā)酵條件下，只激活轉(zhuǎn)氫

9、酶導(dǎo)致異丁醇產(chǎn)量增加了20％，轉(zhuǎn)化率增加了8％。雖然進行NAD激酶單基因調(diào)控對異丁醇的生產(chǎn)沒有效果，但是將NAD激酶和轉(zhuǎn)氫酶一起激活之后，與只進行轉(zhuǎn)氫酶調(diào)控的菌株相比，異丁醇產(chǎn)量提高50％，轉(zhuǎn)化率提高30％