資源描述：
《家蠶尿酸氧化酶基因的克隆及其原核表達(dá)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中文摘要屎酸氧化酶(UrgeOxidase，UO，EC1．7．3，3)是生物體內(nèi)嘌呤代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶，可催化尿酸形成尿囊酸。大多數(shù)的原核和真核生物都有完整的尿酸氧化酶基因，產(chǎn)生具生物活性的尿酸氧化酶，以尿囊酸作為代謝最終產(chǎn)物。在人類和一‘些靈長類動(dòng)物的尿酸氧化酶基因中存在無義突變，尿酸氧化酶不具活性。它們?cè)卩堰式到馔緩街信判鼓蛩嶙鳛樽罱K產(chǎn)物。重組尿隘氧化酶可作為l
2、i{i廢治療高屎酸癥和預(yù)防腫瘤溶解癥候群的有效藥物。利用基因工程方法構(gòu)建高效表達(dá)載體，在適當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)尿酸氧化酶基因，是提高尿酸氧化酶產(chǎn)量的首選方法。在國外已有若干種碌酸氧化酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)出有生物活性的蛋
3、白質(zhì)。但在國內(nèi)還未見此方面的研究。本文在家蠶尿酸氧化酶基因的克隆和高教表達(dá)方面進(jìn)行了研究。利用DNA同源序列，PCR方法擴(kuò)增得到尿酸氧化酶基因，在原核表達(dá)系統(tǒng)pET28一a／E．coliBL21(DE3)中進(jìn)行了表達(dá)。主要包括以下內(nèi)容：1．尿酸氧化酶基因預(yù)測(cè)：研究用生物信息學(xué)方法．利用果蠅的尿酸氧化酶同源序列在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，檢索到的家蠶尿酸氧化酶序列。2．家蠶尿酸氧化酶基因的克隆及原核表達(dá)：根據(jù)預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR檢測(cè)和克隆測(cè)序驗(yàn)證，成功地克隆到家蠶尿酸氧化酶基因的完整開放閱讀框，并克隆到pET28．a(chǎn)載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Escherichia
4、coliBL21(DE3)細(xì)胞。通過IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白，經(jīng)SDS．PAGE分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)，但是通過活性測(cè)定，在粗酶液中并沒有檢測(cè)到有活性的尿酸氧化酶，這可能是因大腸桿菌里表達(dá)真核生物的蛋白質(zhì)，在原核系統(tǒng)里，該蛋白質(zhì)得不到正確的翻譯后修飾，使得該蛋白質(zhì)失去了本有的功能。3家蠶尿酸氧化酶基因的序列分析：克隆的eDNA長為1088bp，ORF長1014bp，編碼337個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為38．18kD，等電點(diǎn)為690，基因名暫定為Bmuo。家蠶尿酸氧化酶在氨基酸水平上與果蠅和按蚊的尿酸氧化酶的相似性分別為45．6％和51％．在第91個(gè)氨基酸殘基處具有Asn．Set—
5、X．Valflle-Val／Ile-Ala／Pro—Thr-Asp-Ser／Thr．x．Lys．Asn的高度保守序列，這一序列在真核生物和原核生物中均廣泛存在，可能與尿酸氧化酶的酶活性有關(guān)。與其他物種尿酸氧化酶的聚類分析中，家蠶與果蠅、按蚊聚為一類，說明昆蟲問結(jié)構(gòu)較保守。關(guān)鍵詞：家蠶；尿酸氧化酶；原核表達(dá)；序列分析AbstractUrateoxidase(uo)，anenzymethatcatalyzestheoxidationofuricacidtoallantoin，playsanimportantroleintilemetabolismofpurines．Mostprokm3'o
6、teandeukaryotehaveintacturateoxidasegene(ZtO)thatproducesurateoxidaseactivityandexcretesallantoinastheendproductofpminemetabolismBecauseofasinglenonsensemutation，humanandcertainnon—humanprimateslackurateoxidaseandexcreteuricacidastheendproductUtilizinggeneengineeringmethodstoconstructepressionve
7、ctorofhighefficiency，andexpressionofuricacidinproperexpressionsystemwhichcanelevateyieldofuricase，ThereareseveraIuricasesbeenclonedandexpressionofbiologyactivityproteinintheEcoiloverseas．Butthereisnoresearchinteriorly．Inthispaperwestudiedontheuricaseofsilkworm，whichutilizedhomologDNAsequenceofDr
8、osophilamelanogasterandPCRtogetDNAsequenceofuricaseinsilkworm，andthenexpressionintheProkaryoticExpressionSystem．CloningandidentificationoftheuricasegeneinBmort，hereinWCpresentamolecularcharacterizationofBmoriwhichincludes：lI
