資源描述：
《家蠶ociad2基因的克隆表達(dá)及其定位研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、浙江理．1：火學(xué)碩七學(xué)位論文家蠶OCIAD2基因的克隆表達(dá)及其定位研究摘要OCIA(ovariancancerimmuno．reactiveantigen)是一類具有跨膜結(jié)構(gòu)的保守蛋白，它們的一個(gè)共同特征是含有OCIA超家族結(jié)構(gòu)域。DC朋基因經(jīng)選擇性剪接后會(huì)產(chǎn)生多種同源異構(gòu)體，編碼的氨基酸序列稍微有差別。我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹eDNA文庫(kù)中獲得一條編碼OCIAD2蛋白的cDNA序列(基因登錄號(hào)為DQ443385)，我們將其命名為BmOClAD2(Bombyxmoriociadproteinisoform2)。該序列的ORF為645bp，編碼214個(gè)氨基酸殘基，基因組序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該序列是由
2、5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子剪接而成。將推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其他物種的相關(guān)蛋白具有一定的同源性。擴(kuò)增BmOCIAD2基因的ORF并克隆到表達(dá)載體pET．28“+)相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，成功·構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET．28“+)．BmOCIAD2，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序證明重組子是正確的。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后，裂解菌體作SDS．PAGE分析，顯示重組蛋白成功表達(dá)，主要以包涵體的形式存在。用尿素溶解包涵體后以親和層析的方法純化重組蛋白His．BmOCIAD2。FPLC反相柱進(jìn)一步純化重組蛋白，質(zhì)譜鑒定測(cè)得該重組蛋白的分子量為27437
3、Da，與理論值相符，進(jìn)一步證實(shí)了該蛋白表達(dá)的正確性。用純化得到的重組蛋白為抗原免疫雄性新西蘭白兔，制備了該重組蛋白的多克隆抗體。間接ELISA方法檢測(cè)該抗血清(多克隆抗體)的效價(jià)可達(dá)到1：12800以上。利用多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明BmOCIAD2蛋白在家蠶四個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，蛹期表達(dá)量最高；在五齡幼蟲(chóng)的睪丸、馬氏管、卵巢、頭的表達(dá)量較高。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)家蠶卵、五齡幼蟲(chóng)、蛹、蛾四個(gè)發(fā)育時(shí)期以及五齡幼蟲(chóng)各組織中BmOCIAD2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，分析發(fā)現(xiàn)在蛹期mRNA含量最高；在五齡幼蟲(chóng)的睪丸、馬氏管、卵巢、氣管、表皮、腸、頭、脂肪體、絲腺中BmOCIAD2的mR
4、NA含量依次減少。用免疫熒光技術(shù)對(duì)BmOCIAD2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，結(jié)果顯示BmOCIAD2蛋白主要存在于家蠶卵巢細(xì)胞系BmN細(xì)胞的細(xì)胞膜中。上述這些結(jié)果都為我們進(jìn)一步研究BmOC認(rèn)D2蛋白的相關(guān)功能提供了重要依據(jù)。關(guān)鍵詞：家蠶；BmOCIAD2；表達(dá)分析；亞細(xì)胞定位I浙江理T大學(xué)碩+學(xué)位論文MolecularCloning，expressionandlocalizationanalysisofOCIAD2genefromSilkworm(BombyxmorOAbstractOCIA(ovariancancerimmuno-reactiveantigen)domainproteinsch
5、aracterizedbyOCIAmotifarenovelconservedproteinswithputativetransmembranedomains．TheOCIAtranscriptsaregeneratedbyalternativespliceandencodeslightlydifferentproteins．AcDNAsequenceencodingociadproteinisoform2wasfoundfromthecDNAlibraryconstructedbyOUtlaboratoryandwasnominatedBmOCIAD2(GenBankaccessionnum
6、berisDQ443385)．TheBmOCIAD2genecontains5exonsand4introns，andtheORFis645bpinlengthencodingaproteinof214aminoacidresidues．MultiplealignmentsandhomologyanalysisshowedthatBmOCIAD2sharesmorethan30％similaritywithotherinsects’relative‘proteins．InordertopreparethepolyclonalantibodyofBmOCIAD2，theORFofthegeneW
7、asclonedintopET-28a(+)vectorandtherecombinantproteinWasexpressedsuccessfullyinEcDliinductedbyIPTG．TheBmOCIAD2WasfusedwithHis．切g(shù)andpurifiedbyNi2+affinitychromatography．Themolecularweightofthisrecombina
