基于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的大麥耐鎘性基因型差異及大小麥耐滲透脅迫差異的機理研究

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1、中文摘要鎘(Cadmium，cd)是毒性最強的重金屬污染元素之～。Cd在環(huán)境中的遷移性強，極易被植物吸收積累，超過～定限度不僅嚴(yán)重影響作物生長發(fā)育，降低其產(chǎn)量和品質(zhì)，而且能通過食物鏈富集，危害人體健康。因此，研究Cd的植物毒性機制，以及植物對Cd脅迫的應(yīng)答機制，對于提高植物對Cd的抗／耐性，改良糧食作物品質(zhì)，降低Cd從植物進入食物鏈的危險性，具有十分重要的理論和實踐指導(dǎo)意義。目前，Cd脅迫對植物生理生化影響的研究大多集中在植株水平上進行，而細(xì)胞生理生化對Cd脅迫是如何反應(yīng)這一研究領(lǐng)域的探索卻相對較少。懸浮細(xì)胞具備很好的均一性，并且對環(huán)境脅迫的反應(yīng)更為敏感和直

2、接。為此，本研究以耐Cd性不同的大麥基因型(萎縮不知，耐Cd基因型；東17，Cd敏感基因型)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，較為系統(tǒng)地研究了Cd脅迫對大麥細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響及其基因型差異；并進一步探討了飼喂Zn、Fe、GSH和SA對大麥細(xì)胞Cd毒害的緩解效應(yīng)與基因型差異及其生理生化機制。此外，我們還培育了大麥(PCIl63)和小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系，并采用24孔板培養(yǎng)方法，研究了鹽(NaCl處理)和干旱(PEG處理)脅迫對細(xì)胞生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的影響，并從基因表達水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機理。主要研究結(jié)果如

3、下：1．以直徑約2咖的幼胚為外植體，建立了萎縮不知和東17兩個大麥基因型的穩(wěn)定均質(zhì)的懸浮細(xì)胞系，初步研究了大麥懸浮細(xì)胞的生長特性，探討了不同水平Cd脅迫對細(xì)胞活力的影響及基因型差異。結(jié)果表明，大麥懸浮細(xì)胞的生長可以明顯分為3個階段：遲滯期(0．3d)、指數(shù)生長期(4．8d)、靜止期(9．12d)，由此進一步確定了大麥細(xì)胞的最佳繼代周期為7．8d。大麥懸浮培養(yǎng)液pH值的變化與細(xì)胞的生長階段存在一定的相關(guān)性，pH值變化的基本趨勢是先迅速下降，再緩慢上升，最后稍有下降。隨著Cd處理時間的延長和濃度的加大，大麥細(xì)胞活力逐步下降，通過細(xì)胞活力及MDA含量兩項指標(biāo)的測定

4、比較，我們確定了Cd脅迫濃度50gM，處理時間5d，作為后繼生理生化研究的試驗處理條件。2．研究了不同濃度Zn、Fe對Cd脅迫下大麥細(xì)胞活力和抗氧化酶活性的影響及基因型差異。結(jié)果表明，Cd脅迫會導(dǎo)致大麥細(xì)胞活力下降、MDA含量上升，敏感基Il因型東17細(xì)胞較耐性基因型萎縮不知細(xì)胞受害嚴(yán)重。50gMCd脅迫下，耐性細(xì)胞系萎縮不知的SOD、POD活性顯著增強，但CAT活性受到抑制。敏感細(xì)胞系東17的SOD、CAT活性在Cd處理1d后有所上升，但處理5d后，活性顯著下降；而POD活性在整個處理時期內(nèi)均顯著高于對照。缺Zn處理和缺Fe處理顯著降低了Cd脅迫下大麥細(xì)胞

5、活力，并導(dǎo)致MDA含量劇烈升高；同時也使得SOD、POD、CAT活性急劇下降。而300洲Zn和500gMFe在一定程度上緩解了Cd脅迫對大麥細(xì)胞造成的氧化損傷，誘導(dǎo)大麥細(xì)胞抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)較單獨Cd處理上升，同時MDA含量有所下降。3．探討了外源GSH和SA對Cd脅迫下大麥細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的影響及基因型差異。結(jié)果表明，50gMCd脅迫誘導(dǎo)耐性基因型萎縮不知大麥細(xì)胞APX、MDHAR活性顯著提高，在處理中后期GR、DHAR活性也顯著上升；而敏感基因型東17在50州Cd脅迫下僅MDHAR活性顯著增強，至處理中后期盡管GR活性有所上升，但APX

6、活性顯著下降，且DHAR活性在整個處理時期內(nèi)均受到抑制。盡管50gMCd脅迫降低了兩基因型大麥懸浮細(xì)胞GSH、AsA含量，并且細(xì)胞內(nèi)GSFFGSSG、AsA／DHA比值亦較對照有所下降，但耐性較強的萎縮不知胞內(nèi)的GSH、AsA含量及GSH／GSSG、AsA／DHA水平較東17高。外源GSH和SA降低了Cd脅迫對大麥細(xì)胞造成的氧化傷害，使得大麥細(xì)胞MDA含量較單獨Cd處理有所下降，而細(xì)胞活力稍有上升。外源GSH顯著提高了Cd脅迫下兩基因型大麥細(xì)胞APX、MDHAR活性及內(nèi)源GSH含量和GSH／GSSG比率；而外源添加SA顯著提高了兩個大麥細(xì)胞系GSH含量和GS

7、H／GSSG比率，同時對萎縮不知大麥細(xì)胞SOD等抗氧化保護酶、AsA—GSH循環(huán)關(guān)鍵酶類以及AsA、AsA／DHA比率也有一定的促進作用。4．以大麥(PCIl63)和小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系為試驗材料，采用24孔板培養(yǎng)方法，探討了鹽和干旱脅迫對細(xì)胞生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量的影響，并進一步從基因表達水平探討了大小麥耐滲透脅迫差異的機理。結(jié)果表明，大麥(PCIl63)和小麥(PC998)細(xì)胞對滲透脅迫的耐性存在差異，其中大麥懸浮細(xì)胞對滲透脅迫的耐性較強。100mMNaCI處理24h后，小麥(PC998)懸浮細(xì)胞系中的活細(xì)胞量顯著下降，而大麥細(xì)胞則無顯著變

8、化。脯氨酸是禾本科植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)劑之一，大