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《抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因PCR檢測及其飼用安全研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因PCR檢測及其飼用安全研究姓名：朱元招申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)指導(dǎo)教師：李德發(fā);王鳳來20040601摘要本論文研究了RR抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆、豆粕及其飼料產(chǎn)品中外源基因的PCR檢測技術(shù)以及系統(tǒng)評價其飼喂動物的安全性。建立大豆及其飼料產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的定性和定量PCR檢測方法。以CTAB和GMO試制盒兩種方法提取基因組DNA。用常規(guī)定性PCR對外源基因盒結(jié)構(gòu)中的不同基因進(jìn)行篩選或特異性擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行回收和酶切鑒定，最低檢測下限為o．1％：在巢式PCR方法中，對大豆模板DNA的
2、檢測下限可達(dá)到pg級水平；利用建立的雙引物PCR技術(shù)同時檢測內(nèi)源和外源基因，檢出來自美國、阿根廷的大豆及飼料為轉(zhuǎn)基因陽性產(chǎn)品．取得良好效果。另外，建立了雙鏈DNASYBRGreenI結(jié)合染料實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，繪制Z∞和CaMV35s基因定量擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，R2值分別達(dá)到o．9997和0．9992；對已知轉(zhuǎn)基因含量的大豆標(biāo)準(zhǔn)品及大豆模擬樣品進(jìn)行定量，實(shí)測值與實(shí)際值相對偏差在5-11％范圍之間。上述PCR方法適用于RR大豆或飼料中轉(zhuǎn)基因成分的定性與定量檢測。通過斷奶仔豬生長試驗(yàn)、’生長豬消化試驗(yàn)和大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)，評價RR抗草甘
3、膦轉(zhuǎn)基岡豆粕的飼用價值和安全性。RR大豆(粕)的常規(guī)概略養(yǎng)分、氨基酸組成、微量元素、脂肪酸組成及胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量在正常范圍值內(nèi)，RR豆粕對斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和血生理生化無明顯影響。生長豬回腸末端安裝T型瘺管試驗(yàn)顯示．RR轉(zhuǎn)基因豆粕粗蛋白質(zhì)、氮鏨酸的回腸表觀消化率及回腸真消化率與常規(guī)豆粕相近；外源cp4epsps基因在生長豬肝臟、肌肉、脾臟和聃腺組織中來被檢出，在食麋和糞便中的檢出率均僅為6．7％。在80只Sprague·Dawley人鼠13wks的Ⅱ慢性安全性試驗(yàn)中，飼喂60％常規(guī)非轉(zhuǎn)基因或RR轉(zhuǎn)基因豆粕日糧的火鼠生k
4、與采食無顯著性差異(P>0．05)；飼喂90％高含量RR豆粕的大鼠血液學(xué)、血清生化和尿液參數(shù)在生理值范圍內(nèi)；試驗(yàn)期內(nèi)無大鼠死亡，大體剖撿和組織病理學(xué)檢驗(yàn)并束發(fā)現(xiàn)體組織有病理學(xué)變化特征；另外，在大鼠咬肌組織未發(fā)現(xiàn)有外源或內(nèi)源DNA殘留。常規(guī)與RR抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(粕)營養(yǎng)組成具有等價性，對斷奶仔豬和生長豬有相同的營養(yǎng)生物學(xué)效價，對大鼠的飼用安全具有實(shí)質(zhì)等同性。關(guān)鍵詞：抗草甘膦大豆，轉(zhuǎn)基因檢測，PCR．飼用安全，生長性能AbstractThispaperwasconductedtostudyPCRmethodsfordetectinge
5、xoticgenesfromgeneticallymodified(GM)RRglyphosate-tolerantsoybeans，soybearlmealandfeedstuffs，andtomakeasafetyassessmentforitsapplicationinanimals．QualitativeandquantitativePCRmethodsfordetectingGMsoybeansanditsderivativefeedstuflgweredeveloped．FirstlygenomicDNAwasobtain
6、edwi也CTABmethodorkitforextractionfromGMO．AfterqualitativePCRwasusedtoscreeningandampli母differenttargetgenesintheexoticgenecassette，thePCRproductswererecoveredandcutfnrtherwiththecorrespondingrestrictiveenzyme．Thelimitofdetectionwas0．1％withqualitativePCR．WhennestedPCRwas
7、employed．a(chǎn)slittleasPgofsoybcantemplateDNAcouldbedetected．Basedonthedetectionwj也double—primerPCR．thesoybearlsandfeedstaffsfromAmericaandArgentinawereGMpositive．Inaddition，real—timequantitativePCRmethodwasdevelopedwitIllluorescencedyeSYBRGreen1whatcombinedtodoublerstrandD
8、NA．Thestandardcurvesof／ecandCaMV35sg：e】／lesweredrawnwithO．9997and0．9992ofR2valuerespectively．Therelativedeviat
