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《抗蟲耐草甘膦多價轉基因玉米的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、東北農業(yè)大學博士學位論文抗蟲/耐草甘膦多價轉基因玉米的研究姓名：赫福霞申請學位級別：博士專業(yè)：植物學指導教師：黃大昉20080620摘要玉米是大宗糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，由于蟲害和草害的威脅，導致其產(chǎn)量和質量嚴重下降?；蚬こ痰恼Q生為玉米蟲害和草害的防治提供了有效手段。G2．epsps基因是從草甘膦長期污染的極端環(huán)境中分離的熒光假單胞菌(psedomonas／luorescensG2)中克隆的新基因，具有自主知識產(chǎn)權。為提高耐草甘膦基因G2一epsps在轉基因玉米中的表達水平，首先對摹岡進行了植物密碼子優(yōu)化，改造后的基岡命名為2raG2．epsps基因，優(yōu)化后基因的e卜c含量由原來
2、的58％調整到了53％，與G2．epsps基因核苷酸序列相似性為89％。為使該草甘膦抗性基因編碼產(chǎn)物正確定位于葉綠體，克隆了擬南芥的EPSPS酶的葉綠體轉運肽序列，大小為244bp，測序結果表明該序列與已知序列的相似性為100％。BtcrylAh基因是從我國自行分離的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)菌株BT8中克隆的新型殺蟲蛋白基因，crylAh基因的編碼產(chǎn)物對鱗翅目害蟲的殺蟲活性強于目前使用的crylAc或者crylAb基因。crylIe基因是本研究組克隆的另一個具有自主知識產(chǎn)權的Bt殺蟲基因，其編碼蛋白對敏感玉米螟和抗性玉米螟均有一定毒力。crylIe與c
3、rylAb和crylAc無交互抗性，將crylAh和crylle構建到同一表達載體中，能夠更為有效地克服現(xiàn)有Bt基因同源性高、種類單一、昆蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性等問題，同時可望獲得抗蟲性更好的轉基因植物?！け狙芯坷每瓜x基因crylAh和耐草甘膦基因2坍G2一epsps構建了雙價植物表達載體，通過基因槍轟擊轉化玉米，以2研G『2．epsps為篩選標記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得到了抗性較好的TO代轉化植株80株。通過對TO、T1、T2代轉基因植株的分子檢測、抗蟲生物活性檢測、田間草甘膦抗性檢測表明，共獲得了5個能夠穩(wěn)定遺傳具有抗蟲性和草甘膦耐受性的轉基因玉米品系。同時構建了含有Btcr
4、ylAh和crylIe基因和耐草甘膦2所G2．epsps基因的三價植物表達載體，通過基因槍轟擊法轉化玉米愈傷組織，以2raG2．epsps為篩選標記基因，以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑，獲得To代轉化植株69株，PCR檢測結果表明：有17株已完整的整合有抗蟲基因crylAh、crylIe和耐草甘膦基因知G2一epsps的3個目的基因，RT-PCR分析外源基因可以正確轉錄，已獲得結實轉基因植株。三價轉基因玉米的獲得為我國多基因雙抗性轉基因玉米的研究打下了基礎，為下一步的玉米育種提供了材料。實驗中以2朋G2．epsps基因作為篩選標記基因，為確定其篩選時間及篩選壓力，進行了玉米愈傷組織對不同濃度草甘膦
5、的抗性實驗，確定向培養(yǎng)基中添加濃度為lmM的草甘膦異丙胺鹽篩選15天能有效的抑制非轉基因玉米愈傷組織的分化，本研究的再生植株的陽性率為45％，為玉米及其它單子葉作物轉化提供了一種有效、安全的篩選體系。關鍵詞：抗蟲／耐草甘膦；crylAh基因：crylIe基因；2歷凹一epsps基因；轉基因玉米；篩選AbswactResearchontheInsect·-Resistant／Glyphosate—-TolerantMutipleGeneTransformationinMaizeAbstractMaizeisnotonlythestaplef．00dcrop，butalso鋤importantra
6、wmaterialforfeedandindustry,neverthelessthethreatofpe啦andweedsleadstOaseriousdeclineinitsoutputandquality．Thebirthofgeneticengineeringprovidesaneffectiveinca／isforthepreventionandtreatmentofpestsandfeeds．G2-epspsgenewasclonedfromaPsedomonasfluorescensstrednG2isolatedfromanextremelyglyphosatepolluted
7、environment,anditWasanovelgenewhichhasbeenpatented．InordertOimprovetheglyphosate-tOlerant(72一epspsgene’sexpressionlevelintransgenicmaiT豫，thecodonofG2-epspsWaSoptimizedaccordingtotheplant’scodonprefere
