PPM1M對NFκB信號通路調控作用的研究

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1、摘要核因子俎(nuclearfactor-r,B,NF-r,B)信號通路活性受到細胞質多種蛋白的精細調控,NF.rd3與這些蛋自質組成了NF.rd3系統(tǒng),多種因素可引起NF.娼信號轉導途徑的激活。NF.rd3調控大量基因的轉錄,特別是一些涉及免疫應答和炎癥應答的基因,NF-rd3信號通路參與了炎癥、細胞增殖、細胞凋亡等方面的調控,萄前所知的NF.r,B所誘導表達的基因大多與細胞的生長和存活有關。蛋白磷酸酯酶2C(proteinphosphatase2C,PP2C)家族成員大多與細胞生長和細胞應激應答的信號通路相關,其中金屬依賴性蛋自磷酸酯酶1A(meta

2、l.dependentproteinphophataselA,PPMlA)、PPMlB、PPMlL、PPMlF、PPMlE、整聯蛋白偶聯激酶相關的磷酸酯酶(integrin-linkedkinase-associatedphosphatase,ILKAP)等PP2C家族蛋白成員直接參與了NF.r,B信號通路主要路徑或旁路的調控,但是PP2C蛋自家族蚤自成員PPMlM的底物與生理功能卻尚未證實,基予PPMlM的結構和序列與上述PP2C家族蛋囪的相似性,我們檢測了PPMlM在NF.進信號通路中的功能。我們采用RNA于擾(RNAinterference,RNA

3、i)技術抑制PpMlM的mRNA表達,從而研究其在NF.rd3信號通路中的作用。本實驗從3條不同的靶向PPMlM的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)qb篩選出最有效瓣l條siRNA,囂PPMlMsiRNA_I,并且用PPMlMsiRNA_I干擾PPMlM后發(fā)現抑制PPMlM的表達會降低NF.xB信號通路的活性。我們表達并純化了PPMlM.GST融合蛋白以用于PPMlM與NF-l:信號通路中蛋白相互作用的研究。另外,本實驗還檢測了腫瘤壞死因子畎tumornecrosisfactor-a,TNFa)在Hela細胞中時間梯度的刺

4、激效應,結果發(fā)現,從0分鐘到30分鐘核因子KB抑制子a(inhibitorofnuclearfactor-r,B0【,Ir33a)的表達量逐漸下降,而60分鐘時Ir,Ba的表達量開始上升,因此我們選擇30分鐘作為PPMlM定位實驗的TNFa刺激時聞。在免疫熒光蛋卷定位實驗中我們發(fā)現:在Hela細胞中,非刺激狀態(tài)和刺激狀態(tài)下PPMlM均定位于細胞質孛,因此我們在穗互作用實驗中選擇NF.r,B信號通路細脆震部位的蛋白作為靶點,并且發(fā)現腫瘤壞死因子受體相關因子2(n幢receptorassociatedfactor2,TRAF2)、核因子避抑制子激酶13(in

5、hibitorofnuclearfactor-r.Bkinase13,IKK§)和p52與PPMlM均有裙互作用。本實驗的研究為PPMlM功能的進一步研究提供了新思路。摘要關鍵詞:RNA干擾核因子心金屬依賴性蛋白磷酸酯酶1M蛋自定位腫瘤壞死因子受體相關因子2核因子避抑制子激酶pp52llAbstractABSTRACTManyproteinsparticipateintheregulationoftheactivityofnuclearfactor-ld3(NF—kB)inthecytoplasm,theseproteinsandNF—kBcompose

6、ofNF—kBsignalsystem.NF—kBsignaltransductionpathwaycallbeactivatedbymanykindsoffactors.NF·kBregulatesthetranscriptionofanexceptionallylargenumberofgenes,particularlythoseinvolvedinimmuneandinflammatoryresponses.NF-r,Bparticipateintheregulationofinflammation,cellproliferationandapo

7、ptosis.IthasbecomeclearovertheyearsthatNF-1cBisapleotropictranscriptionfactorinvolvedintheinducibleexpressionofawidevarietyofgenes,particularlythosethatpromotecellgrowthandsurvival.Amajorityofproteinphosphatase2C(PP2C)familymembersparticipateintheregulationofcellgrowthandincellul

8、arstresssignaling,andthePP2Cfamilymember

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