資源描述：
《傘滑刃線蟲(chóng)屬和外滑刃線蟲(chóng)屬部分種群的分類(lèi)及分子鑒定研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、Y9050’78洳江≥、暗博士學(xué)位論文傘滑刃線蟲(chóng)屬和外滑刃線蟲(chóng)屬部分種群的分類(lèi)及分子鑒定研究作者姓名盤(pán)皇莖指導(dǎo)教師．塑絲惑盔堂學(xué)科(專(zhuān)業(yè))蕉塹病墨堂所在學(xué)院壅些魚(yú)生塹墊盔鱟睦中國(guó)·杭州浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要傘滑刃線蟲(chóng)屬(B“W印^膪n幽W)中松材線蟲(chóng)(B掣卸矧“s)是松樹(shù)癌癥一松樹(shù)萎蔫病的病原物。由于其危害嚴(yán)重和防治困難受到世界各國(guó)的高度重視，很多國(guó)家將其列為檢疫對(duì)象。鑒于該線蟲(chóng)的重要性以及在分離該線蟲(chóng)的過(guò)程中，常分離到該線蟲(chóng)所在屬的其它線蟲(chóng)，本研究對(duì)松材線蟲(chóng)及其所在屬的傘滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行了系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子分類(lèi)與鑒定研究，探索了利用rDlqA的PcR．
2、RFLP、duplex_PcR以及制各松材線蟲(chóng)單克隆抗體等方法構(gòu)建部分傘滑刃線蟲(chóng)的分類(lèi)診斷系統(tǒng)；同時(shí)對(duì)伴隨松材線蟲(chóng)分離到的兩種外滑刃線蟲(chóng)屬種群(松外滑刃線蟲(chóng)和華美外滑刃線蟲(chóng))進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與分子鑒定。本研究對(duì)17個(gè)傘惰刃線蟲(chóng)群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)系統(tǒng)性比較，初步鑒定出8個(gè)松材線蟲(chóng)群體和6個(gè)擬松材線蟲(chóng)群體，2個(gè)明顯區(qū)分于兩者的傘滑刃線蟲(chóng)屬種。應(yīng)用rDNA中ITs的PcR．RFLP分析對(duì)形態(tài)學(xué)特征極其相似的來(lái)自中國(guó)、日本和韓國(guó)的松樹(shù)或木質(zhì)包裝箱中分離出來(lái)的傘滑刃線蟲(chóng)屬6個(gè)群體進(jìn)行了分子鑒別。其中來(lái)自浙江鎮(zhèn)海的松樹(shù)和日本的木質(zhì)包裝箱中分離出的各一線蟲(chóng)群體被鑒定為松材線蟲(chóng)，
3、而來(lái)自浙江富陽(yáng)的松樹(shù)和韓國(guó)、香港及日本的木質(zhì)包裝箱中的另一群體等4個(gè)群體被鑒定為擬松材線蟲(chóng)。本研究中選用的4種限制性?xún)?nèi)切酶(脅礦I、fkPIII、塒印I、c加I)的特異性酶切位點(diǎn)均可以有效地鑒別松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)。同時(shí)對(duì)來(lái)自中國(guó)浙江病死木和中國(guó)香港木質(zhì)包裝箱的兩種傘滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行了形態(tài)與rDNA'PcR—RFLP的分析，結(jié)果顯示來(lái)自浙江的傘滑刃屬線蟲(chóng)為BM加“8，而來(lái)自香港的則為B廊口ik，砌e，兩者均為在中國(guó)首次報(bào)道。此外運(yùn)用clustalxl8、Mega2軟件對(duì)所獲得的上述四種傘滑刃線蟲(chóng)ITs序列以及從GellBank上下載的部分傘滑刃屬線蟲(chóng)序列進(jìn)行比
4、對(duì)，并利用uPGMA法構(gòu)建部分傘滑刃線蟲(chóng)系統(tǒng)樹(shù)，12種傘滑刃線蟲(chóng)形成3個(gè)組群，反映了傘滑刃線蟲(chóng)屬內(nèi)種間的遺傳學(xué)關(guān)系。根據(jù)松材線蟲(chóng)及從GeI】Bank上下載的其他傘滑刃線蟲(chóng)ITs序列，運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行比對(duì)分析，依據(jù)其在ITsl與ITs2上的差異，設(shè)計(jì)了松材線蟲(chóng)種的特異性引物。經(jīng)檢測(cè)，松材線蟲(chóng)種內(nèi)群體能特異性擴(kuò)增出長(zhǎng)約580bp的片段，而擬松材線蟲(chóng)則為陰性，酶切與序列測(cè)定結(jié)果顯示與ITs區(qū)序列相關(guān)部分完全吻合。將用于擴(kuò)增28sRNA基因D2D3區(qū)的通用引物與特異性引物一起進(jìn)行dupIex．PcR擴(kuò)增，結(jié)果所有的松材線蟲(chóng)株系均產(chǎn)生兩大小分別約為770b
5、p和580bp的片段；而其他線蟲(chóng)類(lèi)群只能產(chǎn)生770bp左右的單一片段，無(wú)松材線蟲(chóng)種特異性片段。Duplex，PcR可對(duì)松材線蟲(chóng)進(jìn)行種特異性檢測(cè)，與其它的PcR方法相比，該方法具有靈敏、快速、有效等特點(diǎn)。在對(duì)rDNA中ITs比較的基礎(chǔ)上，該研究還探討了28sRNA基因在分類(lèi)和鑒定中的作用。通過(guò)對(duì)浙江大學(xué)博士學(xué)位論文部分傘滑刃線蟲(chóng)28sRNA基因中的D2D3區(qū)的PcR擴(kuò)增表明：擴(kuò)增的PcR片段大小無(wú)明顯差異。選用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示：除松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)的酶切圖譜比較接近外，其他線蟲(chóng)如四，口加“圻、口曲“f砌?出P、B如洲拘酶切圖譜差異
6、較大，因此可利用限制性?xún)?nèi)切酶構(gòu)建酶切圖譜以相互區(qū)別。在松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)的酶切圖譜中發(fā)現(xiàn)，髓自』236I能將兩者區(qū)分開(kāi)，結(jié)合該內(nèi)切酶對(duì)其它線蟲(chóng)的酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)其對(duì)28sRNA基因D2D3區(qū)的酶切可用于鑒定傘滑刃線蟲(chóng)屬的不同種群。此外對(duì)本研究中的四種傘滑刃線蟲(chóng)，結(jié)合從GeneBank上下載的部分傘滑刃線蟲(chóng)的28sRNA基因D2D3區(qū)序列構(gòu)建傘滑刃線蟲(chóng)種群的系統(tǒng)樹(shù)，構(gòu)成的聚類(lèi)組群與ITs區(qū)聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。此外本研究還系統(tǒng)的探索了利用單克隆抗體對(duì)松材線蟲(chóng)特異性鑒定。利用松材線蟲(chóng)勻漿液免疫BALB／c小鼠，取其脾細(xì)胞與sP2，o骨髓瘤細(xì)胞融合獲得一株能穩(wěn)定
7、傳代并分泌針對(duì)松材線蟲(chóng)單克隆抗體(Mab)的雜交瘤細(xì)胞，命名為1D3，經(jīng)ELIsA檢測(cè)其特異性好、效價(jià)達(dá)到5．12×105，抗體類(lèi)型為IgGl亞類(lèi)。westem_blot分析表明，1D3單克隆抗體株與松材線蟲(chóng)勻漿液有明顯反應(yīng)。這為正確鑒別松材線蟲(chóng)與擬松材線蟲(chóng)又提供了一快速、靈敏有效的診斷方法。這是國(guó)際上首次獲得松材線蟲(chóng)單克隆抗體。在形態(tài)學(xué)比較及鑒定的基礎(chǔ)上，首次報(bào)道了外滑刃線蟲(chóng)屬兩種群的rDNA的特征。通過(guò)對(duì)ITs和28sRNA基因中D2D3區(qū)的PcR擴(kuò)增和序列分析，兩者PCR擴(kuò)增片段大小各異，酶切圖譜差異明顯，說(shuō)明同屬的這兩種線蟲(chóng)在分子水平存在較明顯的差
8、異，這與其形態(tài)上存在相當(dāng)差異的結(jié)果相吻合。因此不僅可利用ITs．P
