《細(xì)胞的換液與傳代》PPT課件

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1、細(xì)胞系與細(xì)胞克隆教學(xué)目的：1、掌握傳代培養(yǎng)的概念和方法2、了解細(xì)胞系的建立過程3、掌握克隆細(xì)胞的幾種方法細(xì)胞系cellline：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代后即成。有限細(xì)胞系finitecellline:不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限。連續(xù)細(xì)胞系continuouscellline：可連續(xù)傳代的細(xì)胞系，即已建成的細(xì)胞系。細(xì)胞株cellstrain：通過選擇法和克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)和標(biāo)志的培養(yǎng)物。有關(guān)概念一、傳代培養(yǎng)（passage）概念：無論是否稀釋，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶。（一）傳代培養(yǎng)的方法

2、1、從生長(zhǎng)器皿上解離細(xì)胞的方法：1）震蕩法。2）胰蛋白酶消化法3）胰蛋白酶-檸檬酸鹽4）用EDTA洗細(xì)胞再用胰蛋白酶-檸檬酸鹽處理5）EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化6）EDTA洗再用胰蛋白酶-膠原酶配合檸檬酸鹽或EDTA消化7）機(jī)械刮削法（scraping）8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.01mg/ml)2.單層培養(yǎng)細(xì)胞的一般傳代步驟:倒出舊液PBS洗滌胰蛋白酶消化吸出消化液加入培養(yǎng)液吹散細(xì)胞計(jì)數(shù)稀釋培養(yǎng)離心法：離心后去上清，加培養(yǎng)液，吹打，傳代。直接傳代法：將細(xì)胞慢慢沉淀，將上清吸去1/2-2/3，加培

3、養(yǎng)基，傳代。3、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(二)傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、傳代時(shí)機(jī)與傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度：細(xì)胞沒生長(zhǎng)到足以覆蓋的瓶底壁的大部分表面前，不要急于傳代。2、傳代數(shù)或代數(shù)：指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。3、盡量少傳代，避免轉(zhuǎn)化。二、細(xì)胞系的建立正常細(xì)胞系建立的程序包括：原代培養(yǎng)第一次傳代常規(guī)傳代和凍存、復(fù)蘇等階段。細(xì)胞系的維持細(xì)胞系檔案要記錄好：組織來源、培養(yǎng)基要求、傳代時(shí)間等；傳代換液有規(guī)律，否則會(huì)引起生物學(xué)特性改變；多種細(xì)胞維持傳代，要防止交叉污染；要有充足的凍存儲(chǔ)備，防止因污染造成絕種；另外，細(xì)胞暫時(shí)不用，最好凍存，以免老化或性狀改變。

4、1、證明細(xì)胞系的種系。染色體分析、同工酶分析、DNA指紋技術(shù)。2、明確細(xì)胞系的組織來源細(xì)胞抗原標(biāo)記的方法3、細(xì)胞是否是正常細(xì)胞，有無發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞二倍體特征，惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞為異倍體。4、細(xì)胞有無交叉污染。同工酶方法是快速有效的，每一個(gè)細(xì)胞系在瓊脂糖電泳上有特異的同工酶帶型。DNA指紋技術(shù)也可以鑒定。鑒定細(xì)胞系的內(nèi)容：三、細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆（clone）是指單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體，他們的遺傳特性相同。細(xì)胞克隆化培養(yǎng)（cellcloningculture）：又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)，是指將單個(gè)細(xì)胞在一定支持物上增殖培養(yǎng)而產(chǎn)生

5、細(xì)胞群落的過程。（一）克隆培養(yǎng)技術(shù)稀釋鋪板法飼養(yǎng)層克隆法膠原膜板瓊脂克隆法等分類：1.稀釋鋪板法：最常用消化—低密度細(xì)胞懸液制備—接種—標(biāo)記與培養(yǎng)—分離擴(kuò)大培養(yǎng)—觀察—移植瓶或皿內(nèi)培養(yǎng)稀釋鋪板法圖解注意事項(xiàng)：1）確保一個(gè)細(xì)胞2）輪廓清晰完整，體積適宜健康3）不需換液2、飼養(yǎng)層克隆法飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）：也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線或絲裂霉素C處理過的供其它細(xì)胞附著的細(xì)胞層。成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。注意：3周內(nèi)飼養(yǎng)細(xì)胞即死亡，要及時(shí)應(yīng)用飼養(yǎng)層克隆圖解3、膠原膜板或血纖維蛋白膜板克隆法：1）膠原膜板或血纖維蛋白膜板

6、的制備2）消化、稀釋、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞血纖維蛋白膜板制備A液：0.2μg凝血酶,100ml培養(yǎng)液B液:250mg牛血纖維蛋白原、800mgNaCl、25mg檸檬酸鈉、1000毫升雙蒸水A：B=4：14、瓊脂克隆法：用于病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞。2%瓊脂母液--45℃水浴--混合成0.33%瓊脂培養(yǎng)液加入試管內(nèi)2.5ml--45℃水浴瓊脂克隆法圖解5、在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆化2%瓊脂母液--45℃水?。ō傊敢汉?倍濃度培養(yǎng)液）--1：1混合--45℃水浴—鋪板—細(xì)胞懸液內(nèi)加等體積的1.5%甲基纖維素混合后鋪于瓊脂層上培

7、養(yǎng)在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆化圖解（二）影響克隆形成率的因素克隆形成率(cloningefficiency)是指向底物接種單細(xì)胞懸液能形成細(xì)胞小群的百分?jǐn)?shù)影響因素：1、細(xì)胞密度。10個(gè)/ml2、培養(yǎng)液。HamF12k3、血清4、飼養(yǎng)細(xì)胞5、激素和生長(zhǎng)因子：胰島素，地塞米松，EGF，BFGF。6、CO27、適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì)：膠原層，血漿纖維蛋白層，多聚右旋賴氨酸，纖維連接蛋白，瓊脂（三）克隆的分離克隆化環(huán)分離法2、射線照射分離克隆法將培養(yǎng)瓶倒置放于X射線或鈷60源下，用2mm厚的鉛片蓋住選中的克隆。3、懸浮細(xì)胞克隆分離24孔板加入

8、1ml培養(yǎng)液—用毛細(xì)吸管吸取群落—吹入培養(yǎng)板內(nèi)1、概念：細(xì)胞系，細(xì)胞株，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞克隆，克隆形成率2、鑒定細(xì)胞系應(yīng)包含的內(nèi)容3、常見的克隆培養(yǎng)技術(shù)有哪幾種，簡(jiǎn)要敘述其技術(shù)要點(diǎn)4、影響克隆形成率的因素5、克隆分離的方法和技術(shù)要點(diǎn)作業(yè)謝謝大家！