豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鑒定

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity碩士學(xué)位論文Master’sThesis中文論文題目:豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鑒定英文論文題目：Identificationofinteractionproteinofporcinecircovirustype2ORF3protein學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)作者姓名：徐霄指導(dǎo)教師：于威教授全滟平副教授完成日期：2018年4月17日浙江理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，，是本：我恪守學(xué)術(shù)道德崇尚嚴(yán)謹學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文人在導(dǎo)師

2、的指導(dǎo)下，獨立進行研宄工作所取得的成果。除文中己明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容，。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負責(zé)并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：４ｈ＇／ｆ／Ａ＆４日期：／年月日浙江理工大學(xué)￥位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)浙江理工大學(xué)可以將

3、本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進。行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文保密口。，在年解密后使用本版權(quán)書本學(xué)位論文：屬于不保密。‘「卜ｓｉ學(xué)位論文作荇簽名：曰期：年Ｉ月３曰＼＼＼＾１指導(dǎo)教師簽名：ｈｉ期：年ｂｒｎ浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鑒定摘要豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2,PCV2）屬于圓環(huán)病毒科，作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（post-wean

4、ingmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）的主要病原體，目前對其具體致病機制，特別是病毒與宿主細胞之間的相互作用機制的研究相對匱乏。PCV2屬于單股負鏈環(huán)狀的DNA病毒，其基因組全長約1.7kb，主要含有3個的開放閱讀框（openreadingframe,ORF），分別為ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF3編碼的105aa的病毒復(fù)制非必需蛋白會誘導(dǎo)細胞凋亡。特異性抗體是研究蛋白功能的重要工具。本研究通過構(gòu)建pET28a-ORF3原核表達載體，獲得表達重組ORF3蛋白

5、的基因工程菌，經(jīng)尿素變性及鎳柱純化的方法得到高純度的重組ORF3蛋白，通過免疫新西蘭大白兔制備獲得PCV2ORF3蛋白的多克隆抗體。制備的多克隆抗體能夠特異性結(jié)合ORF3蛋白的線性表位，但不能識別ORF3蛋白的構(gòu)象表位。為探究ORF3蛋白與宿主細胞的相互作用關(guān)系，本研究建立穩(wěn)定表達帶有SFB標(biāo)簽的ORF3蛋白的PK-15細胞株。利用串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法，篩選到33個與ORF3蛋白相互作用的細胞蛋白，分別涉及細胞骨架、分子伴侶、能量代謝等。經(jīng)免疫共沉淀和亞細胞共定位技術(shù)驗證，分子伴侶CCT5蛋白

6、與ORF3蛋白存在特異性相互作用。本研究通過串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)并鑒定到一個ORF3蛋白的互作蛋白CCT5，為深入研究ORF3蛋白及其互作蛋白在PCV2的病毒復(fù)制及致病機制中的作用奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；ORF3蛋白；CCT5；互作蛋白I浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文豬圓環(huán)病毒2型ORF3蛋白互作蛋白的鑒定AbstractPorcinecircovirus2(PCV2)whichbelongstotheCircovirusfamilycausespost-weaningmultisystemic

7、wastingsyndrome.ThestudyonthepathogenicmechanismofPCV2andtheinteractionbetweenhostcellandvirusisstillunclear.Thegenomeisasingle-strand,negative-senseDNAofapproximately1.7kbthatcontainsthreemainlyopenreadingframes,ORF1,ORF2andORF3.ORF3encodeda105aaprotein

8、thatwasnotessentialforviralreplicationbutinducedapoptosis.Specificantibodiesareimportanttoolsforstudyingproteinfunction.Inthisstudy,expressionvectorpET28a-ORF3wasconstructedtoobtaintherecombinantbacteria.ExpressedHis-tagge