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《豬圓環(huán)病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、測序及原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、豬圓環(huán)病毒2型吉林地方株ORF2基因的克隆、測序及原核表達摘要豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovims，PCv)為圓環(huán)病毒科圓、環(huán)病毒屬成員，可分為PCvl和PCv2兩個血清型。PCVl無致病性，廣泛存在于豬體及豬源細胞系內(nèi)；PCV2有致病性，是引起斷乳豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMws)的病原之一。PMWS是繼繁殖與呼吸綜合征之后出現(xiàn)的又一豬免疫抑制性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，已引起世界各國的廣泛重視。對Pcv進一步研究表明，Pcvl和PcV2均含有兩個主要的開放閱讀框，即ORFl和ORF2。ORFl編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白Rep蛋白。此蛋白在
2、兩型病毒之間有85％的同源性，是PcVl、PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要蛋白質(zhì)。OI心2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(Cap蛋白)。該蛋白在兩型病毒之間同源性為68％，不存在交叉反應(yīng)，且具有較好的免疫原性，對豬圓環(huán)病毒病的診斷與疫苗研究有較大的意義。本研究根據(jù)GeIlBallk中發(fā)表的PcV2ORF2基因序列，設(shè)計合成一對特異性引物，用PCR方法從接種經(jīng)過鑒定的PCV2吉林株(兒01)PK一15細胞中，擴增出PCV2JL01毒株的ORF2基因。將擴增片段克隆于pMD．18T載體，進行序列測定。結(jié)果表明，PCV2兒01毒株的ORF2基因核苷酸長度為7
3、02bp。利用分子生物學軟件對PCV2幾01株ORF2基因與GeIlBaIlk中發(fā)表的國內(nèi)外其他參考毒株0RF2基因進行核苷酸序列同源性比較。結(jié)果表明：PCV2兒01株ORF2基因的核苷酸序列與國內(nèi)不同毒株間的同源性較高，而與國外毒株問該基因核苷酸的同源性相對較低，這可能是不同地區(qū)病毒在與宿主相互作用過程中適應(yīng)宿主免疫反應(yīng)的進化結(jié)果。根據(jù)基因分析，設(shè)計一對引物，從克隆的pMD．ORF2重組質(zhì)粒擴增出大小為585bp的部分ORF2基因片段(ORFs)，克隆到pMD．18T載體中，之后轉(zhuǎn)入表達載體pET．32a，經(jīng)salI和xhoI酶切鑒定，得到陽性重組表達
4、質(zhì)粒pET．ORFs。將重組質(zhì)粒pET．0RFs轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21中，經(jīng)終濃度為1mmol幾的IPTG誘導(dǎo)，成功表達了0RF2基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。經(jīng)We咖1．Blot檢測表明，表達的重組蛋白能夠被PCV2陽性血清所識別。由此說明，重組表達的PCV2部分OI江2蛋白具有良好的反應(yīng)原性。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型，0RF2基因，克隆，表達C10ning，SequencingandExpressingofC妊己F2GeneofPorcineCircovimsType2Is01atedf如mJilinPmvinceAbstractPorcinecircoVir
5、usisamemberofCircoviridae，whichcaIlbedi“dedintotwotypes，PCVl柚dPCV2．PCV2c鋤c跏seadise船en鋤edpostweaningmunisystemicwastings”drome儼Mws)'whereasPcVlisubiqunous鋤dn伽pathogenicforpigs．PMwshasmadeagreat10ssinworld’sswineindustryandarousedpeOple’sanention．B0thPCVlalldPcV2Wereknowedthattlley
6、con協(xié)in2m匈or叩enread{ng仔aITles(ORF)matareoRFlaIldORF2．oRFlencodesaput8tiVepmteininvolvedinviralreplication(Repprotein)．RepprotejnofPCVlsharcsabout85％identhywnthatofPcV2，which{sthemajorrcasonofPcVlandPcV2havecrossIreactionof鯽tigenic吼oRF2-codingproductismemajorsmlctIlralpmtein．Thispr
7、oteinsharesabout68％identi母betweentwotypesvims；}loweveLnocmss_reactionofantigenicjtyisobservedbetWeenthem．Therefore，theORF2genecanbeusedt0di脯rentiacePCVIa11dPCv2．AccordingtothenucleotidesequencesofpublishedporcinecircoVimst)，pe2(PCV2)inGellB柚k，apa打ofprimersthatwerespecinctotheORF2
8、geneofPCV2weredesign酣a11dsynthesizedinth
