《疫細(xì)胞分離試驗(yàn)》PPT課件

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1、免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù)免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù)臨床上的各種類(lèi)型的免疫缺陷、自身免疫病以及腫瘤等疾病均可出現(xiàn)淋巴細(xì)胞或淋巴亞群的數(shù)量和功能的變化。因此用體外方法對(duì)機(jī)體具有免疫反應(yīng)的外周血淋巴細(xì)胞及其亞群的數(shù)目或比例以及它們所顯示的功能的強(qiáng)弱進(jìn)行檢測(cè)，是判斷機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種重要手段。這對(duì)于臨床認(rèn)識(shí)疾病、探討其發(fā)病機(jī)制、觀察病情變化、判斷預(yù)后、考核療效和防治疾病等方面均有重要意義。免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù)免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù)用途體外進(jìn)行細(xì)胞免疫檢測(cè)要求分離的淋巴細(xì)胞純度高、產(chǎn)量多，而且不喪失活性，同時(shí)也要求分離技術(shù)簡(jiǎn)單、操作方便。原理外周血液中紅細(xì)胞和白

2、細(xì)胞的比例在幾百甚至上千比一，兩類(lèi)細(xì)胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。利用自然沉降法、密度梯度離心法或二者結(jié)合，可以將淋巴細(xì)胞從血液中分離出來(lái)。免疫細(xì)胞分離和保存技術(shù)常用方法：葡聚糖-泛影葡甲胺密度梯度離心法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation）。分離特點(diǎn)：分離純度高，可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％，其中T淋巴細(xì)胞占80％，B淋巴細(xì)胞占4～10％。分離原理：ficoll-hypaque混合溶液，又稱(chēng)淋巴細(xì)胞分層液，血液中各有形成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的ficoll-hy

3、paque混合溶液（又稱(chēng)淋巴細(xì)胞分層液）作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由于密度較低，故懸浮于分層液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大，故沉于分層液的底部；淋巴細(xì)胞密度稍低于分層液，故位于分層液界面上，這樣就可獲得淋巴細(xì)胞。一、免疫細(xì)胞分離以豚鼠為例，講解免疫細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)及其具體步驟．采血前的準(zhǔn)備用注射器取3ml淋巴細(xì)胞分層液于一試管中.再用注射器吸?。瞞l的阿氏液，并保存在注射器中．一、免疫細(xì)胞分離心臟采血取血前應(yīng)探明心臟搏動(dòng)最強(qiáng)部位，通常在胸骨左緣的正中，選心跳最顯的部位作穿刺。針頭宜稍細(xì)長(zhǎng)些，以免發(fā)生手術(shù)后穿刺孔出

4、血.因豚鼠身體較小，一般可不必將動(dòng)物固定在解剖臺(tái)上，而可由助手握住前后肢進(jìn)行采血即可。一、免疫細(xì)胞分離取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3毫升淋巴細(xì)胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。一、免疫細(xì)胞分離2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸淋巴細(xì)胞層到1.5ml離心管中加5倍體積的Hanks液，然后心（1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘）棄上清即成。重復(fù)離心一次離心之前一定要配平一、免疫細(xì)胞分離一、免疫細(xì)胞分離用毛細(xì)吸管吸取界面處的淋巴細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞，置于離心管中，用Ｈanks重復(fù)離心兩次（1000r/min離心10min），最后用h

5、anks液配成1×107個(gè)細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞懸液.一、免疫細(xì)胞分離心臟采血把采取的血液輕輕沿壁注入到試管中．并輕輕搖晃幾次．二、家兔紅細(xì)胞分離取家兔阿氏液混合的血液，以Hanks洗三次（2000r/min離心10分鐘）。然后，將壓積紅細(xì)胞用Hanks液配制成1%懸液。二、家兔紅細(xì)胞分離三、免疫細(xì)胞的保存和活力測(cè)定1、分離細(xì)胞的保存?（1）短期保存?用含有10%~20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI?1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周（2）長(zhǎng)期保存及復(fù)蘇保存：在保護(hù)劑二甲亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過(guò)程是：先對(duì)需凍存的細(xì)胞作活細(xì)

6、胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，立即放入降溫過(guò)渡站(-80℃)中，繼而進(jìn)行降溫(-196℃)冷凍。三、免疫細(xì)胞的保存和活力測(cè)定復(fù)蘇：將其從液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。2、細(xì)胞活力的檢測(cè)?常用方法是臺(tái)盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過(guò)活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）。