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《歐美楊組培體系的建立和Trx基因的遺傳轉(zhuǎn)化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、東北}^業(yè)J、學(xué)塒I學(xué)位淪上摘要本研究首先建立了歐美楊組培體系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究建立了其組織培養(yǎng)和再生系統(tǒng)，通過(guò)此系統(tǒng)可在短期內(nèi)獲得大量擴(kuò)繁植株，得出不同階段最佳培養(yǎng)基與激素含量為：(1)再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1／2MH+6-BA0．5mgrL-1+NAA0．05mgrL．1；(2)繼代培養(yǎng)基：MH+6．BA0．5mg·L．1+NAA0．05mg·U1；(3)抽莖培養(yǎng)基：MH+6一BA0．1mg·L_1+NAA0．05mg-L1；(4)生根培養(yǎng)基：MH+IBAO．3mg·L1。然后將從抗旱、耐鹽植物檉柳(Tamarixandrossowii)中克隆
2、得到的硫氧還蛋I芻(Thioredoxin，Trx)基因Trx，成功構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2，并對(duì)其進(jìn)行釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證檉柳Trx基因的功能，同時(shí)將其構(gòu)建到載體pROKll上并獲得攜帶1’Ⅸ的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Trx基因?qū)霘W美楊基因組中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因歐美楊的干旱脅迫試驗(yàn)，對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。將Tm基因與酵母表達(dá)載體pYES2連接，獲得了pYES2—1h重組質(zhì)粒。將pYES2．Trx轉(zhuǎn)化酵母茵INVScI。隨機(jī)挑選2個(gè)INVScl(pYES2-Trx)單菌落，經(jīng)PCR擴(kuò)增證明Trx基因已構(gòu)建到pYES2載
3、體上。對(duì)1NVScl(pYES2-Trx)和INVSd(pYES2)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，研究外源基因Trx在酵母中的的表達(dá)情況。重組酵母INVSel(pYES2-Trx)的NaCI、Na2C03、NaHC03、干旱，紫外線等脅迫實(shí)驗(yàn)證明，INVScl(pYES2．Trx)酵母的抗逆性明顯高于對(duì)照INVScI(pYES2)菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在酵母受到逆境脅迫時(shí)，Trx基因表達(dá)的硫氧還蛋白對(duì)酵母細(xì)胞起到了保護(hù)作用，同時(shí)也證實(shí)了來(lái)源于檉柳的Trx基因具有提高真核生物抗逆性的功能。通過(guò)對(duì)歐美楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲33株卡那霉素抗性芽，從中選出長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)的10
4、個(gè)株系，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，初步證明Trx基因已整合到歐美楊基因組中：對(duì)lO個(gè)株系進(jìn)行Northern雜交，其中7個(gè)株系出現(xiàn)雜交譜帶，證明Trx轉(zhuǎn)基因能夠在這7株系中轉(zhuǎn)錄。分別對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了干旱脅迫試驗(yàn)，分析逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因歐美楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諝W美楊株系間丙二醛(MDA>含量、相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉綠素含量、相對(duì)生長(zhǎng)量等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，干旱脅迫處理8d時(shí)，轉(zhuǎn)基因歐美楊相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照歐美楊的9．17％；對(duì)照歐美楊MDA含量為30．015um01．91，而轉(zhuǎn)基因歐美楊MDA含量大多在2
5、6IIt001．g_l左右，低于對(duì)照歐莢楊；此時(shí)轉(zhuǎn)基因歐美楊的葉綠素平均含量為28．090mg．g一，高于對(duì)照的23．233％，而SOD平均活性高于對(duì)照的90．0％：對(duì)f旱脅迫8d時(shí)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)生長(zhǎng)量進(jìn)行調(diào)查，各轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)生長(zhǎng)量大于對(duì)照株系的相對(duì)生長(zhǎng)量，說(shuō)明硫氧還蛋自基因的導(dǎo)入提高了歐美楊的抗旱能力。綜合以上：結(jié)果，硫氧還蛋白基因的組成型表達(dá)能夠不同程度提高轉(zhuǎn)基因歐美楊干旱脅迫下細(xì)胞膜穩(wěn)定性、SOD活性、葉綠素含量及相對(duì)，￡長(zhǎng)量。說(shuō)明硫氧還蛋白基因具有提高植物抗旱性的功能。關(guān)鍵詞歐美楊：硫氧還蛋白基因；遺傳轉(zhuǎn)化；干旱脅迫llIAbst
6、ractTissuecultureandregenerationsystemofPoplar(P口deltoides×P．nigra，‘shandisI’)wasestablishedinourexperiment．Plantgrowthregulatoralpha·naphthylaceticacid(NAA)andcelldivisionelement．6-animalpenaminopurine(6一BA)wereused，inourexperiment，toinducebudsandclumpshoots．1ndolebutyric
7、acid(IBA)wasusedforrootgenerationandgrowth．Thefollowingwasthemediaandhormoneusedinthepoplartissueculture：1／2MHculturemedium伯一BA0．5mg·olandNAA0．05mg-L-1)wasusedtoinduceandobtaintheregeneratedbuds；蛐culturemedium(6·BA0．5mg-L-1andNAA0．05mg·L1)wasusedtogenerateclumpbuds；刪cultur
8、emedium(6-BAO．1mg-L-1andNAA0．05mg·L1)wasusedtoobtainstrongshoots；1／2Ⅲculturemedium(IBA0．3
