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1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究姓名：應(yīng)飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治指導(dǎo)教師：謝明20070601摘要阿特拉津是均三氮笨類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草幫，J’泛用于玉米、高粱、甘蔗、果園等防除一年生禾本科雜草及闊葉雜草，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。阿特拉津在全世界火面積推廣應(yīng)用后，其對(duì)農(nóng)珥及地下水酶污染、對(duì)壓茬作耪的藥襄、對(duì)人類潛在的遺傳毒性笛融題日益突出。為了利用安全高教的生物降解技術(shù)控制和消除阿特拉洋在農(nóng)田環(huán)境中的殘留污染，本研究分離、篩選對(duì)阿特拉津具有贏效降解能力的菌株，研究了降解菌及其降解酶特性，為開發(fā)和應(yīng)用酶制劑提供基礎(chǔ)。本研究結(jié)果對(duì)控
2、制農(nóng)田污染，促進(jìn)糧食安全生產(chǎn)，保障人類身體健康，僳護(hù)生態(tài)環(huán)境均其有重要意義。具體研究結(jié)果如F：應(yīng)用搖瓶釀l化珞莽方法，從潷北、山農(nóng)等墻農(nóng)藥廠捧污[：：l淤泥中分離得到4株對(duì)§玎特拉津有降解能力的細(xì)菌；比較菌株對(duì)阿特拉津的降解效率，從中篩選fⅡ1株高效降解新菌株BZB一1。運(yùn)用形態(tài)與生理生純特征獲發(fā)16SrDNA穿列分析等方法對(duì)菌株BZB一1送行鑒定。其形態(tài)及生理生化特征：革蘭氏陰性菌，細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，無芽孢，極生鞭毛，具有運(yùn)動(dòng)性，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶雕性。該菌株為好氧、氧化型(菲發(fā)酵型)細(xì)港，能利用葡萄糖和乙醇，不能利用甲醇和乳酸，可以利用氨態(tài)氮和硝態(tài)氮優(yōu)合物，NaCl的耐受濃度為0．5
3、～2％，生長(zhǎng)漏度耐受范圍為4q5℃。精氨酸脫羧酶陰性，晦氫酸脫羧酶陰性，賴氨酸脫羧酶陰性，枸櫞酸鹽陰性，硝酸鹽還原陰性，尿酶陽(yáng)性，七葉靈(蓊)水解酶羯性，蛋彝胨水(靛基質(zhì)試驗(yàn))陰性，o一硝基萃一B—D鴦E曛半乳糖苷酶(ONPG)陰性，蔗糖水解酶陽(yáng)性，麥芽糖水解酶陽(yáng)性，木糖水解酶陽(yáng)性，葡萄糖水解酶
4、；日性，硫化氫陰性。BZB．1菌株的16SrDNA基閑序列與Shinellagranuli(顆粒申氏桿菌)的同源性達(dá)到99％，結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生億特性，綜合判定該菌株為Shinellagranuli，此屬種類在我國(guó)未見報(bào)道。研究明確了顆粒申氏桿菌ShinellagranuliBZB．1菌
5、株生長(zhǎng)的基本規(guī)律和基本條件。顙粒申氏桿菌ShinellagranuliBZB．1菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，o一6h處于延遲生躍期，6*20h對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2011阻罱進(jìn)入穩(wěn)定及衰亡期；菌株BZB．1對(duì)溫度的透癍范圍較廣，在4-～454C的條件下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30Z：；菌株適宜的pH儆為6～9之間，最適pH為7；菌株生長(zhǎng)對(duì)氧的需求量不贏，菌體有高濃度發(fā)酵生產(chǎn)的潛力。通過研究還明確了環(huán)境醫(yī)予對(duì)BZB一1蘑株降解效率的影響。葙用氣相色譜監(jiān)測(cè)底物(阿特拉溶)變化量，5町特拉津底物濃度對(duì)降解率有顯著影響，當(dāng)阿特拉津濃度較低時(shí)(200mg／L)，菌株BZB一1在3天內(nèi)即可將
6、其完全晦解(未檢出，撿測(cè)聚為0．01ng／p1)，隧§玎轉(zhuǎn)拉津濃度升高，其完全降解的時(shí)間也相應(yīng)明顯延長(zhǎng)。接菌量對(duì)降解效率有顯著影響，隨著培養(yǎng)基中接種的菌體濃度的提高，阿特拉津的降解率也逐漸增加，在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，當(dāng)接菌濃度從2．56×106c／h／ml增赫到3．28×108cfulml時(shí)，其稆應(yīng)的降解率從54．o％提高到99．7％。pH德對(duì)降解率有顯著影嚷，當(dāng)pH值為6—7時(shí)，菌株的降解效率較高(96．1—100％)，pH值大于7時(shí)或pH值小于6時(shí)，降解率明強(qiáng)降低(pH值為8對(duì)，降搬效率為54．O％；prt值為5丑寸，降解率為79．7％)，降解最適pH為7。溫度對(duì)降解率的影響明嶷
7、，瀚株降解的最適溫度為20—35。C，其降解率均大于98．3％，當(dāng)溫度小于20℃(88．8％)或高于35℃時(shí)(89．1％)．菌株的f鋒解力瑪開媲明顯下降。為了明確菌株降解酶的利用價(jià)值，本文研究了降解酶粗酶液的基本特性。通過酶定位實(shí)驗(yàn)，明確了該菌株豹§時(shí)特拉津降解酶位子緩胞內(nèi)，粗酶渡與阿特拉津(底物濃發(fā)50mgm，pH7。0，磷酸緩沖液體系3ml，溫度30*(2)作用2h，其對(duì)底物的去除率可達(dá)到99．0％。結(jié)果表明，菌株BZB．1分泌的降解酶為組成型酶，在無底物誘導(dǎo)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基}：連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)8代后，該菌對(duì)阿特拉津的降解能力仍保持在較高水平，底物誘導(dǎo)前后該菌對(duì)阿特拉律的降解能力
8、無顯著變化。溫度對(duì)粗酶液降解活性的影響明鼴，降解酶適宜的溫度為25—35℃，35℃時(shí)粗酶液對(duì)阿特拉津的降解率為73．5％(酶與底物作用O，5h)，離漱會(huì)使酶瓣酶解活性驟然下降(40。C酶對(duì)底物的降解率為34．5％)。pH對(duì)粗酶液降解活性的影響明疆，當(dāng)pH值為5～9．2，酶的活性隨pH值的升高而上升，pH值為9．2時(shí)酶的活性最高(69．6％，酶與底物作用時(shí)間0．5h)。由此看來，該菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定(組成摯酶)，降解酶對(duì)溢度、pt-I的適應(yīng)范羽較j、‘，對(duì)底物的降
