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《藥物在肝微粒體酶的體外代謝研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、藥物在肝微粒體酶的體外代謝研究色譜小組：湯明海2016.04.28藥物研發(fā)過程中可能會(huì)遇到的問題?在進(jìn)行新藥（包括中藥）研發(fā)的歷程中，您可能會(huì)面臨和解決這樣的問題:?1.新藥前體是否被肝臟藥物代謝酶系統(tǒng)代謝，造成口服生物利用度低下？（即體外代謝穩(wěn)定性評(píng)價(jià),Invitrometabolicstabilitystudy）?2.如果新藥前體被肝臟顯著代謝，是何種酶系參與該新藥前體的代謝？（即體外代謝表型的鑒定,Invitrometabolicphenotypeidentification）?3.如新藥前體被肝
2、臟顯著代謝，其代謝產(chǎn)物是什么，其毒性或藥效如何？（即體外代謝產(chǎn)物的鑒定,Invitrometaboliteidentification）?4.新藥前體是否能抑制或誘導(dǎo)肝臟藥物代謝酶系，進(jìn)而影響其它藥物的藥效和安全？（即體外抑制評(píng)價(jià)和誘導(dǎo)評(píng)價(jià),Invitroinhibitionorinductionstudy）?5.新藥前體在何種動(dòng)物代謝特征與人相似，進(jìn)而為臨床前研究的動(dòng)物選擇提供依據(jù)？（即體外人和動(dòng)物代謝特征研究,Invitrometabolismprofilinginanimalsandhumans）
3、P450酶?肝微粒體酶中最主要的是細(xì)胞色素P450(CytochromeP450)氧化酶，簡(jiǎn)稱P450酶，酶蛋白中所含血紅素與一氧化碳（CO）的結(jié)合體P450-CO在450nm處有特征性強(qiáng)吸收峰而得名。它存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是一個(gè)酶系統(tǒng)?？纱呋瘮?shù)百種藥物的氧化過程。P450酶氧化藥物的過程?復(fù)合：藥物首先與氧化型細(xì)胞色素P450Fe3+結(jié)合成復(fù)合物。?還原：P450Fe3+-藥物接受還原輔酶Ⅱ提供的電子，由輔酶Ⅱ細(xì)胞色素C還原酶?jìng)鬟f，還原成P-450Fe2+藥物。?接受一分子氧：P450Fe2+藥物中
4、的低鐵血紅素能與分子氧結(jié)合。?再接受電子還原：O—P—Fe2+—藥物再接受兩個(gè)電子，由NADPH提供2或由還原輔酶Ⅰ供給，NADH-細(xì)胞色素b還原酶?jìng)鬟f，激活分子氧成5兩個(gè)離子氧。?氧化：一個(gè)離子氧使藥物氧化，另一個(gè)與氫結(jié)合成水。同時(shí)，P450-Fe2+失去一個(gè)電子，而氧化再生成P450-Fe3+。因此可被反復(fù)利用用而起催化作用。藥物與P450酶的關(guān)系?酶的底物（substrates）：由P450酶代謝?酶的抑制劑（inhibitors）：藥酶活性減弱，使其他藥物或本身代謝減慢,占代謝性相互作用的70%
5、?酶的誘導(dǎo)劑（inducers）：藥酶活性增強(qiáng)，使其他藥物或本身代謝加速，占代謝性相互作用的23%主要的P450酶?涉及藥物代謝的CYP主要為CYP1、CYP2、CYP33個(gè)家族中7種重要的亞型：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CPY2D6、CYP2E1和CYP3A4常見P450抑制劑和誘導(dǎo)劑代謝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)?代謝穩(wěn)定性考察的是化合物被代謝的難易程度和體外清除率的大小，常用體外代謝半衰期（T）和固有清除率（CL）表示。一般通過定1/2int量測(cè)定目標(biāo)化合物在酶孵育體系中的清除情況
6、來計(jì)算。孵育系統(tǒng)?每個(gè)孵育體系總體積為200μL，體系包括0.1M的PBS緩沖液（pH=7.4）188μL，NADPH發(fā)生系統(tǒng)12μL。冰浴上將1～2μL的藥物加入孵育體系中，在37℃水浴中預(yù)熱5min；然后冰浴上加入5μL的肝微粒體酶，輕輕混勻，置于37℃水浴中孵育，在0min～60min設(shè)置5、6個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集樣品。待反應(yīng)完畢之后加入400μL含內(nèi)標(biāo)的冰甲醇溶液終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中加入孵育體系中的藥物體積控制在1%以內(nèi)，以防止溶解藥物的有機(jī)溶劑對(duì)肝微粒體有滅活作用。結(jié)果計(jì)算?將孵育0min時(shí)間點(diǎn)待測(cè)化合物
7、的濃度作為100%，其他孵育時(shí)間點(diǎn)的濃度轉(zhuǎn)換為百分剩余量，將各時(shí)間點(diǎn)的百分剩余量的自然對(duì)數(shù)對(duì)孵育時(shí)間作線性回歸，求算得斜率k，根據(jù)公式，T=-0.693/k可以計(jì)算1/2得到體外半衰期。肝微粒體中的清除率（CL,mL·min?1·mg?1）=0.693/t(min)×孵育液(mL)/肝微粒體(mg)。1/2代謝表型?代謝表型指特定代謝酶對(duì)目標(biāo)化合物代謝相對(duì)貢獻(xiàn)的測(cè)算，以確定參與藥物代謝的主要酶，為預(yù)測(cè)個(gè)體差異和藥物-藥物相互作用提供依據(jù)。理想的候選化合物的代謝轉(zhuǎn)化是由多種酶介導(dǎo)，并且不是由一個(gè)高度多態(tài)性
8、的酶介導(dǎo)。代謝表型主要測(cè)定方法包括重組酶、選擇性化學(xué)抑制劑、抗體抑制劑三種方法，其中選擇性化學(xué)抑制劑法以其操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用。代謝表型實(shí)驗(yàn)和結(jié)果計(jì)算?本研究的目的是利用肝微粒體體外代謝孵育體系，通過底物消除法，測(cè)定加入不同選擇性化學(xué)抑制劑后對(duì)藥物的代謝消除的影響，考察在肝微粒體中參與代謝化合物的主要CYP450酶。?數(shù)據(jù)計(jì)算：用待測(cè)物的消除速率表示藥物在微粒體孵育體系中的代謝速率；抑制率(%)=（1-加入抑制劑樣品代謝速率/陽
