細胞凋亡與增殖的原位檢測

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1、細胞增殖與凋亡的原位檢測技術一、細胞增殖活性原位檢測技術細胞增殖(cellproliferation)是細胞數(shù)量的增加，其快慢即為增殖活性。①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到DNA復制之前的間隙時間；G1長短不同，是造成細胞周期差異的主要原因。②S期(synthesisphase)，指DNA復制的時期，③G2期(gap2)，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細胞分裂開始到結束。細胞周期圖G0期細胞：細胞暫不分裂，但在適當?shù)拇碳は驴芍匦逻M入

2、細胞周期依據(jù)細胞的分裂能力，機體的細胞分為三類：不穩(wěn)定細胞(labilecells)，持續(xù)分裂細胞穩(wěn)定細胞(stablecells)，靜止細胞處G0期永久細胞(permanentcells)，不可逆地脫離細胞周期，不再分裂的細胞，又稱終端細胞根據(jù)細胞周期將細胞群分為兩類分裂細胞指進入G1期后進行分裂的細胞；非分裂細胞是指處于G0期細胞及非增生的終末細胞。腫瘤細胞群也如此。增殖分數(shù)或生長分數(shù)分裂細胞與細胞總數(shù)之比值。生長分數(shù)值越大，增殖活性越高。測定生長分數(shù)能判斷細胞群的增殖活性，即增殖快慢。生理狀態(tài)下：不穩(wěn)定

3、細胞、穩(wěn)定細胞呈現(xiàn)著活躍或較活躍的增生，補充因凋亡而喪失的細胞，保持機體、器官或組織細胞數(shù)量的動態(tài)平衡。病理狀態(tài)下：反應性增生組織細胞損傷或炎癥刺激等均可引起細胞增生；腫瘤性增生腫瘤的本質是細胞增生紊亂。即使去除刺激因素，瘤細胞仍可持續(xù)增生。原位研究細胞增生活性，不僅涉及生理性及反應性細胞增生，更多是研究腫瘤細胞的增生活性。（一）原位檢測細胞增生活性的常用方法及注意事項測定細胞增生活性的方法有：核分裂像計數(shù)Feulgen染色后顯微分光光度法免疫組織（或細胞）化學技術顯示與細胞增生與分裂相關的抗原嗜銀核仁組織區(qū)

4、法(argyrophil-staineducleolarorganizerregionAgNORs)3H標記胸腺嘧啶脫氧核苷摻入標記技術溴脫氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脫氧核苷相似物）標記技術流式細胞術測定S期細胞分數(shù)1.核分裂像計數(shù)核分裂像是人們可直接識別的細胞周期不同階段的唯一細胞形態(tài)。因此，用光學顯微鏡就能進行計數(shù)。核分裂像計數(shù)有兩種方法高倍視野法（HPF）一般在400倍放大下，隨機選擇一定數(shù)量（10個或更多）的HPF，分別觀察并計數(shù)其中的核分裂像，最后算出平均每個HPF中的核分裂像數(shù)。核分裂指數(shù)（MI）測量

5、時，可在顯微鏡目鏡內放置網格測微尺，隨機選擇一定數(shù)量的視野，計數(shù)不同區(qū)域一定數(shù)量的網格內核分裂像數(shù)，最后算出占所測細胞總數(shù)之比例，實質上是一種生長分數(shù)。注意事項：嚴格控制切片厚度在較厚的切片觀察時，微調顯微鏡可在不同平面計數(shù)核分裂像，與較薄切片相比，顯然增加了計數(shù)機會。組織標本固定時間若組織不及時固定，細胞仍有分裂機會，也會增加核分裂計數(shù)可能性。切片不能過染切片過染會導致核分裂像辨認困難。用同一臺或HPF面積相同的顯微鏡計數(shù)2.免疫組織（或細胞）化學方法通過染色細胞增生相關的核蛋白判斷細胞的增生活性。Ki67

6、因其所測的蛋白只表達在G1，G2，M和S期的細胞，G0期及G1早期細胞不表達。PCNA是針對增殖細胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的抗體。在除G0期外的其它時相細胞均可測出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期達高峰，S期維持高水平，G2期開始下降，G1早期和M期表達水平最低。MCM蛋白（微染色體維持蛋白）是啟動DNA復制和延伸的關鍵蛋白。只在具有增殖潛能和增殖細胞中表達。可顯示整個細胞周期細胞。DNA拓撲異構酶Ⅱa是一種核酶，參與DNA復制、基因轉錄

7、、染色體聚集及催化有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體分離，在細胞增殖中其重要作用。細胞周期中不同時期的關卡蛋白或調節(jié)元件細胞周期素A、B、C、D、E周期素依賴性激酶（CDK）Ki67或PCNA抗原在核內表達．故增生細胞的核呈棕色或紅色，用蘇木素襯染也能清楚區(qū)分陽性與陰性細胞。Ki67Ki67腸腺瘤腸腺癌Ki67Ki67PCNAPCNAPCNAKi67LI，PCNALI采用計數(shù)核分裂像的方法，計數(shù)并算出標記細胞與所測細胞總數(shù)之比，稱為標記指數(shù)（1abellingindex，LI），也是一種生長分數(shù)。腸腺瘤腸腺癌3.DN

8、A含量測定正常體細胞含二倍體基因組DNA。S期的DNA合成使細胞遺傳信息增加。并可出現(xiàn)二倍體以上甚至四倍體DNA。因此，能測量DNA含量的方法，如胸腺嘧啶標記、溴脫氧尿核甙摻入、流式細胞術及Feulgen染色后均可測定細胞的DNA含量。Feulgen染色后顯微分光光度計或計算機圖像分析能在原位檢測DNA含量。Feulgen染色測定時以組織中的靜息淋巴細胞DNA含量為二倍體對照，與所測細胞比較，就可測