3細(xì)胞凋亡與增殖的原位檢測120227

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1、細(xì)胞增殖與凋亡的原位檢測技術(shù)一、細(xì)胞增殖活性原位檢測技術(shù)細(xì)胞增殖(cellproliferation)是細(xì)胞數(shù)量的增加，其快慢即為增殖活性。①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時(shí)間；G1長短不同，是造成細(xì)胞周期差異的主要原因。②S期(synthesisphase)，指DNA復(fù)制的時(shí)期，③G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時(shí)間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細(xì)胞分裂開始到結(jié)束。細(xì)胞周期圖G0期細(xì)胞：細(xì)胞暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は?/p>

2、可重新進(jìn)入細(xì)胞周期依據(jù)細(xì)胞的分裂能力，機(jī)體的細(xì)胞分為三類：不穩(wěn)定細(xì)胞(labilecells)，持續(xù)分裂細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞(stablecells)，靜止細(xì)胞處G0期永久細(xì)胞(permanentcells)，不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞周期將細(xì)胞群分為兩類分裂細(xì)胞指進(jìn)入G1期后進(jìn)行分裂的細(xì)胞；非分裂細(xì)胞是指處于G0期細(xì)胞及非增生的終末細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞群也如此。增殖分?jǐn)?shù)或生長分?jǐn)?shù)分裂細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比值。生長分?jǐn)?shù)值越大，增殖活性越高。測定生長分?jǐn)?shù)能判斷細(xì)胞群的增殖活性，即增殖快慢。

3、生理狀態(tài)下：不穩(wěn)定細(xì)胞、穩(wěn)定細(xì)胞呈現(xiàn)著活躍或較活躍的增生，補(bǔ)充因凋亡而喪失的細(xì)胞，保持機(jī)體、器官或組織細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)平衡。病理狀態(tài)下：反應(yīng)性增生組織細(xì)胞損傷或炎癥刺激等均可引起細(xì)胞增生；腫瘤性增生腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞增生紊亂所致。即使去除刺激因素，瘤細(xì)胞仍可持續(xù)增生。原位研究細(xì)胞增生活性，不僅涉及生理性及反應(yīng)性細(xì)胞增生，更多是研究腫瘤細(xì)胞的增生活性。（一）原位檢測細(xì)胞增生活性的常用方法及注意事項(xiàng)測定細(xì)胞增生活性的方法有：核分裂像計(jì)數(shù)Feulgen染色后顯微分光光度法免疫組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)顯示與細(xì)胞增生

4、與分裂相關(guān)的抗原嗜銀核仁組織區(qū)法(argyrophil-stainednucleolarorganizerregionAgNORs)3H標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷摻入標(biāo)記技術(shù)溴脫氧尿嘧啶核苷（胸腺嘧啶脫氧核苷相似物）標(biāo)記技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)測定S期細(xì)胞分?jǐn)?shù)1.核分裂像計(jì)數(shù)核分裂像是人們可直接識別的細(xì)胞周期不同階段的唯一細(xì)胞形態(tài)。因此，用光學(xué)顯微鏡就能進(jìn)行計(jì)數(shù)。核分裂像計(jì)數(shù)有兩種方法高倍視野法（HPF）一般在400倍放大下，隨機(jī)選擇一定數(shù)量（10個(gè)或更多）的HPF，分別觀察并計(jì)數(shù)其中的核分裂像，最后算出平均每個(gè)HP

5、F中的核分裂像數(shù)。核分裂指數(shù)（MI）測量時(shí)，可在顯微鏡目鏡內(nèi)放置網(wǎng)格測微尺，隨機(jī)選擇一定數(shù)量的視野，計(jì)數(shù)不同區(qū)域一定數(shù)量的網(wǎng)格內(nèi)核分裂像數(shù)，最后算出占所測細(xì)胞總數(shù)之比例，實(shí)質(zhì)上，也是一種生長分?jǐn)?shù)。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格控制切片厚度在較厚的切片觀察時(shí)，微調(diào)顯微鏡可在不同平面計(jì)數(shù)核分裂像，與較薄切片相比，顯然增加了計(jì)數(shù)機(jī)會。組織標(biāo)本固定時(shí)間若組織不及時(shí)固定，細(xì)胞仍有分裂機(jī)會，也會增加核分裂計(jì)數(shù)可能性。切片不能過染切片過染會導(dǎo)致核分裂像辨認(rèn)困難。用同一臺或HPF面積相同的顯微鏡計(jì)數(shù)2.免疫組織（或細(xì)胞）化學(xué)方法通過

6、染色細(xì)胞增生相關(guān)的核蛋白判斷細(xì)胞的增生活性。Ki67因其所測的蛋白只表達(dá)在G1，G2，M和S期的細(xì)胞，G0期及G1早期細(xì)胞不表達(dá)。PCNA是針對增殖細(xì)胞核抗原（proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）的抗體。在除G0期外的其它時(shí)相細(xì)胞均可測出。但水平不一，G1期迅速增加，G1/S交界期達(dá)高峰，S期維持高水平，G2期開始下降，G1早期和M期表達(dá)水平最低。MCM蛋白（微染色體維持蛋白）是啟動DNA復(fù)制和延伸的關(guān)鍵蛋白。只在具有增殖潛能和增殖細(xì)胞中表達(dá)?？娠@示整個(gè)細(xì)胞周期細(xì)

7、胞。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱa是一種核酶，參與DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、染色體聚集及催化有絲分裂和減數(shù)分裂的染色體分離，在細(xì)胞增殖中其重要作用。細(xì)胞周期中不同時(shí)期的關(guān)卡蛋白或調(diào)節(jié)元件細(xì)胞周期素A、B、C、D、E周期素依賴性激酶（CDK）Ki67或PCNA抗原在核內(nèi)表達(dá)．故增生細(xì)胞的核呈棕色或紅色，用蘇木素襯染也能清楚區(qū)分陽性與陰性細(xì)胞。Ki67Ki67腸腺瘤腸腺癌Ki67Ki67PCNAPCNAPCNAKi67LI，PCNALI采用計(jì)數(shù)核分裂像的方法，計(jì)數(shù)并算出標(biāo)記細(xì)胞與所測細(xì)胞總數(shù)之比，稱為標(biāo)記指數(shù)（1abe

8、llingindex，LI），也是一種生長分?jǐn)?shù)。腸腺瘤腸腺癌3.DNA含量測定正常體細(xì)胞含二倍體基因組DNA。S期的DNA合成使細(xì)胞遺傳信息增加。并可出現(xiàn)二倍體以上甚至四倍體DNA。因此，能測量DNA含量的方法，如胸腺嘧啶標(biāo)記、溴脫氧尿核甙摻入、流式細(xì)胞術(shù)及Feulgen染色后均可測定細(xì)胞的DNA含量，但能在原位檢測者，是Feulgen染色后顯微分光光度計(jì)或計(jì)算機(jī)圖像分析，F(xiàn)eulgen染色測定時(shí)以組織中的靜息淋巴細(xì)胞DNA含量為二倍體對照。與所測細(xì)胞比