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《實驗一蘇云金芽孢桿菌ICP基因的檢測》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、微生物遺傳部分實驗四、T4噬菌體基因組rII區(qū)域不同基因突變的互補導語T4是研究得最深入的一類大腸桿菌烈性噬菌體，其基因組是雙鏈線性DNA分子，約有1.7x105堿基對，編碼的蛋白質超過135種。T4基因組的兩端具有約3～6kb的正向重復序列，全長比其頭部長650倍，意味著T4DNA是高度螺旋、緊密折疊地裝配在頭部中。T4基因組rII區(qū)域有2個基因rIIA和rIIB，這2個基因突變均表現(xiàn)為快速溶菌，這種快速溶菌突變型的生長對大腸桿菌的不同品系具有選擇性：突變型若感染E.coliC菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，
2、因此將E.coliC菌株稱為受納性寄主；突變型若感染E.coliK菌株，則不能復制其DNA,因此不能形成噬菌斑，因此將E.coliK菌株稱為限制性寄主。S.Benzer巧妙地利用這一特點設計了經(jīng)典的互補實驗，首次證明順反子（Cistron即基因）是一個必須保持完整才具有正常生理功能的遺傳物質最小的功能單位。一個基因或一個順反子是一個完整的結構，所以屬于同一基因的兩個突變型不能互補，如果兩個突變型能夠互補，就說明它們屬于不同的基因突變，影響的不是同一功能。導語T4噬菌體是一類專性寄生的原核生物，只能在寄主細胞內(nèi)繁
3、殖。噬菌體比細菌繁殖速度快得多，典型的細菌一般在30min內(nèi)由1個變?yōu)?個，而1個T4噬菌體在相同的時間內(nèi)可以形成將近100個左右的子代噬菌體，因此2h后當細菌和噬菌體都繁殖了4代時，細菌的數(shù)目是24＝16，而噬菌體的數(shù)目卻是1004＝108！導語自從1917年發(fā)明在平板上觀察噬菌斑（plaque）的方法后一直延續(xù)至今，噬菌體濃度的測定也是通過計數(shù)噬菌斑的多少。100個細菌在平板上會形成100個菌落，若108個細菌在平板上會融合在一起形成一個渾濁層，稱為“l(fā)awn”，為使菌體能形成均勻的一層，首先將細菌混合在少
4、量熱的液體瓊脂中，然后倒在固體平板的上層，這一液體瓊脂稱為Topagar或Softagar，它會迅速凝固形成一個光滑的表層，細菌在這一薄層中會長得非常均勻。如果有1個噬菌體存在，它將會感染細菌，隨后被感染的細菌裂解后釋放100～200個子代噬菌體，它們又去感染附近的細菌，如此延續(xù)下去幾個小時，噬菌體就會把這一區(qū)域的細菌全部吃光，在渾濁均勻層上形成一個清晰透明的洞，稱為plaque,因為1個噬菌體形成1個plaque，故噬菌體的濃度便可以計算出。噬菌體的濃度單位稱為噬斑形成單位，表示：PFU/mL。一、實驗目的通
5、過實驗了解基因互補的原理，并確定幾個T4快速溶菌突變型是否屬同一基因突變。二、實驗原理將2個不同的T4rII突變型共同感染限制性寄主E.coliK菌株,若2個突變的噬菌體不是影響相同的功能,則可表現(xiàn)互補使其各自的DNA在E.coliK菌株中得以復制,在復制過程中相互重組,進而形成了野生型的噬菌體,野生型的噬菌體經(jīng)反復感染和裂解限制性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。將一系列表型相同的rII突變型,雙雙混合感染限制性宿主進行互補實驗，全部rII突變型可以區(qū)分為rIIA和rIIB兩個互補群，同屬于rIIA或rIIB的兩個
6、突變型在混合感染中沒有互補作用，任何一個rIIA突變型和任何一個rIIB突變型在混合感染中都有互補作用，使表型恢復正常。一系列rIIA突變型在染色體上所占的區(qū)域稱為順反子A，一系列rIIB突變型在染色體上所占的區(qū)域稱為順反子B，由于rII突變型均為點突變，故實驗中必須要有檢測回復突變的對照。三、實驗材料和用具菌種：E.coliC(受納性寄主)和E.coliK（限制性菌株）過夜培養(yǎng)物T4rII突變型26，28，29：點樣濃度為1x108/ml,倒平板濃度為1x109/mlHA平板9塊（效價測定用5塊）HSA試管3
7、mLx9只20?l、200?l移液器各一支，Tip48oC水浴四．實驗方法和內(nèi)容（一）噬菌體T4裂解液的制備1．雙層平板法制備裂解液（1）將E.coliC接種3mLHB中，37℃震蕩培養(yǎng)5—6小時。（2）制備HA平板，待凝固后置50℃烘30分鐘備用。（3）取小試管一只，加0.5mL菌懸液，加0.2mL濃度為105～106的T4儲存液，再加入3mL50℃左右的HSA（軟瓊脂培養(yǎng)基），混合均勻后倒在HA平板上層，凝固后37℃培養(yǎng)過夜。（4）用涂棒將HA平板上層軟瓊脂刮入離心管，加入3mLHB，靜置30分鐘，加2—3
8、滴氯仿，劇烈震蕩半分鐘。（5）4000rpm離心15min，取出上清液，加幾滴氯仿，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃ㄒ唬┦删wT4裂解液的制備2．液體法制備裂解液（1）將E.coliC接種3mLHB中，37℃震蕩培養(yǎng)2~3小時。（2）加入1%體積的T4儲存液（或單噬斑1個），繼續(xù)震蕩培養(yǎng)5小時，一般應測OD600值，當OD值下降又回升時停止培養(yǎng)。（3）加2~3滴氯仿，震蕩半分鐘，4000rpm離心
