細(xì)胞破碎與分離設(shè)備

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1、第六章細(xì)胞破碎與料液分離設(shè)備細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。細(xì)胞破碎定義為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。生物類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（幾丁質(zhì)）（80-90%）脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁細(xì)胞壁

2、的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅固；酵母葡聚糖的細(xì)纖維構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，甘露聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高；植物細(xì)胞次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。常用破碎方法分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模

3、操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活機(jī)械法進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑

4、（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。膠體磨德國進(jìn)口珠磨機(jī)2.高壓勻漿法（High-pressur

5、ehomogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用高壓勻漿器的排出閥易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過勻漿器閥的次數(shù)大、中、小型高壓勻漿器利用發(fā)射

6、15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）影響超聲波的細(xì)胞破碎效率因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時間等。超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。該法在實驗室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。非機(jī)械法1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵

7、內(nèi)切酶殼多糖酶等利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的缺點：溶酶價格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的