細(xì)胞的破碎與分離包涵體

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1、細(xì)胞的破碎與分離概述很多生化產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)(胞內(nèi)產(chǎn)物)細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎(chǔ)。胞內(nèi)物分離概述藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟(jì)肉瘤細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)back酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚

2、糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞破碎機(jī)理圖細(xì)胞破碎細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅(jiān)固；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎1.珠磨法（Beadmill）細(xì)胞破碎高壓勻漿器細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎超聲破碎法（Ultrasonication在15-25kHz的頻率下操作。其原理可能與空化現(xiàn)象（cavitationph

3、enomena）引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)?？昭ㄅ萦捎谑艿匠暡ǖ难杆?zèng)_擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質(zhì)中的懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能聽到的聲音的頻率范圍超聲次聲細(xì)胞破碎撞擊破碎化學(xué)破碎方法酸堿法表面活性劑有機(jī)溶劑化學(xué)破碎方法通用性差；時(shí)間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易

4、于固液分離和進(jìn)一步提取。物理破碎方法滲透壓沖擊凍融法細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計(jì)算其破碎率。破碎率的測(cè)定破碎率的測(cè)定0.05%美藍(lán)染色結(jié)果基因工程包涵體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心，收集上清→純化胞內(nèi)周質(zhì)表

5、達(dá)：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性包涵體：指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。形成原因：表達(dá)量過高、過快外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)

6、物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;能避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集;簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作;能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白。體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包涵體獲得幾種常見的工藝路線(一)機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性包涵體獲得

7、幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性1）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類雜質(zhì)。洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。包涵體的溶解包涵體的分離和蛋白質(zhì)復(fù)性二硫鍵目的次級(jí)鍵變性劑去污劑還原劑