巴戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化影響的實驗研究

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1、福建中醫(yī)學院學報2004年6月第14卷第3期16JournalofFujianCollegeofTCMJune2004914(3.實驗研究.巴戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化影響的實驗研究王和鳴9王力9李楠(福建中醫(yī)學院骨傷系9福建福州350003摘要:為探討巴戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化的影響9采用含藥血清的方法體外培養(yǎng)骨髓基質細胞9分A組(巴戟天水提物組~B組(巴戟天醇提物組~C組(對照組~D組(經(jīng)典成骨誘導組~E組(巴戟天水提物+經(jīng)典成骨誘導組~F組(巴戟天醇提物+經(jīng)典成骨誘導組9觀察各組堿性磷酸酶染色~茜素紅染色~堿性磷酸酶比活性及骨鈣素含量9

2、結果顯示堿性磷酸酶染色和茜素紅染色反應強弱的順序為F組>E組>D組>B組>A組9C組為陰性9堿性磷酸酶比活性和骨鈣素(BGP含量測定結果為:A~B~D~E~F組在同一時間點均高于C組(P<0.059E組~F組在同一時間點均高于D組(P<0.05,說明巴戟天水提物及醇提物均能促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化9且巴戟天醇提物的作用強于水提物,關鍵詞:巴戟天9大鼠模型9骨髓基質細胞9成骨細胞9分化9影響中圖分類號:R285.5文獻標識碼:A文章編號:10045627(200403001605骨髓基質細胞(bonemarrowStromalcellS9(中國原子能科

3、學研究所等,BMSCS具有多向分化潛能9它在不同的誘導條2巴戟天水提物~巴戟天醇提物的制備件下9能向成骨細胞~成軟骨細胞~成纖維細胞~脂2.1巴戟天水提取物的制備:巴戟天產(chǎn)地福建9肪細胞等中胚層組織細胞分化[1],近年來研究表500g粉碎后加雙蒸水8倍9浸泡2h9煮沸1h9明9體外可以誘導BMSCS分化為成骨細胞[2]9在收集藥液9再加雙蒸水6倍9煮沸1h9收集藥液9常用的誘導方法中9多選擇地塞米松~維生素C再加雙蒸水9煮沸1h9合并3次藥液9以3000r/和B甘油磷酸鈉作為主要誘導劑9為研究中醫(yī)藥min離心30min9取上清液94冰箱保存,在BMSCS成

4、骨誘導分化中的作用9我們選用中2.2巴戟天醇提取物的制備:巴戟天500g粉藥巴戟天作為研究對象9采用中藥血清藥理學的碎9以95%乙醇回流提取3次9每次1h9回收乙方法體外培養(yǎng)BMSCS9觀察其不同活性部位的巴醇至盡9浸膏備用94冰箱保存,戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化的影響,2.3含巴戟天水提物~巴戟天醇提物血清的制備:給SD大鼠灌胃的劑量相當于臨床等效劑量9實驗材料(根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比率1儀器與試劑:倒置相差顯微鏡(日本OLYM表'計算,每日劑量分2次口服9連續(xù)給藥3d9第PUS9CO2培養(yǎng)箱(德國~eraeuS9DU650紫外4d1

5、次服用全天劑量9采血前禁食12h9末次給分光光度計(美國BECKMAN9MEM(~y藥1h后采血,以3000r/min離心15min9分離Clone9新生牛血清(NCS9~yClone9青鏈霉素血清956水浴930min滅活920冰箱保存?zhèn)淙芤?~yClone9~EPES(上海生工9胰蛋白酶(1用,=2509AMRESCO9B甘油磷酸鈉(BGP9實驗方法Sigma9地塞米松(Sigma9VitC(上?；瘜W試劑公司9堿性磷酸酶(ALP和總蛋白試劑盒(南京1大鼠MSC的分離與培養(yǎng):取30d齡SD大鼠建成生物工程研究所9骨鈣素(BGP放免試劑盒的股骨和脛骨9去除

6、附著的軟組織9切去骺軟骨9收稿日期:20040315基金項目:國家自然科學基金資助項目(No.30271630作者簡介:王和鳴(19439男9教授9主要從事骨折愈合研究,第3期王和鳴等;巴戟天對骨髓基質細胞向成骨細胞分化影響的實驗研究17暴露髓腔,注射器吸取含15%NCS的O-MEM培3.2茜素紅染色法;各組誘導至第21d時,吸去養(yǎng)液反復沖洗,沖洗液移入離心管,1OOOr/min成骨細胞誘導液,PBS洗3次,95%酒精固定1O離心5min,沉淀用15%NCS的O-MEM培養(yǎng)液min,加入O.1%茜素紅-TriS-Hcl(pH8.3)37C,反復吹打制成細胞

7、懸液,細胞計數(shù)板計數(shù)有核細3Omin,鏡下觀察結果O胞數(shù),調整有核細胞數(shù)為2>1O5/ml,接種于25O3.3堿性磷酸酶比活性的測定;每組各設3孔,ml培養(yǎng)瓶中,置37C~5%CO2~95%空氣的二氧各組分別誘導至第1~3~6~9~12d進行堿性磷酸化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)O接種72h后半量換液,以后酶比活性的測定O測定時取培養(yǎng)液,分別按堿性磷每2~3d換液1次,至15d細胞會合成單層,用酸酶和總蛋白試劑盒說明書進行操作,堿性磷酸O.25%胰蛋白酶消化,按1=3的比例進行傳代接酶比活性計算;堿性磷酸酶比活性(U/mg)=堿種培養(yǎng),并標記為F1,傳代培養(yǎng)過程中每2~

8、3d性磷酸酶活性(U/L)+蛋白濃度(mg/L)O換液1次,直至細