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1、重組標(biāo)簽蛋白的親和純化GST-tagHis-tagMBP-tagStrep(II)-tagZhanyongZhao(趙戰(zhàn)勇)ProductSpecialistofProteinSeparationGEHealthcareHotline:8008109118M:13386153366E：zhanyong.zhao@ge.com1/GE/內(nèi)容1.重組標(biāo)簽蛋白2.GST標(biāo)記融合蛋白的純化3.His標(biāo)記融合蛋白的純化4.MBP標(biāo)記融合蛋白的純化5.Strep(II)標(biāo)記融合蛋白的純化2/GE/11.重組標(biāo)簽蛋白為什么重組蛋白?天然蛋白重組蛋白天然存在比較少、經(jīng)過(guò)重組可以快速純化比較困難、科
2、表達(dá)大量目標(biāo)蛋白、學(xué)研究往往需要比有一套比較成熟的較多的目標(biāo)蛋白。純化方案、完全滿足科研需求。4/GE/2重組蛋白應(yīng)用TherapeuticsDiagnosticAgricultureRecombinantFunctionalstudiesproteinIndustrialStructuralenzymesstudiesBasicResearch5/GE/重組蛋白表達(dá)流程RNA2HNcDNACOOH2HNPlasmidHostCellCOOH6/GE/3表達(dá)系統(tǒng)ProcessingBacteriaYeastInsectMammaliancellscellsInclusionbodi
3、es++--Secretion+/-+--Glycosylation-+++Proteolytic+/-+/---cleavage+-=Yes=No7/GE/重組構(gòu)建RecombinantL+TagProteinMediumLigandTagcleavagesiteBead8/GE/4重組構(gòu)建標(biāo)簽配基GlutathioneS-transferase(GST)GlutathionePolyhistidineNickelions(orothermetalions)MaltoseBindingProtein(MBP)AmyloseStrep(II)-tagStrepTactin9/GE/
4、標(biāo)簽蛋白優(yōu)勢(shì):劣勢(shì):簡(jiǎn)單親和純化即可實(shí)現(xiàn)可能需要切除標(biāo)簽驗(yàn)證方便標(biāo)簽可能影響蛋白結(jié)構(gòu)/功能方便柱上復(fù)性增加產(chǎn)量(表達(dá)/穩(wěn)定性)增加溶解性/折疊促進(jìn)分泌/定位10/GE/5表達(dá)驗(yàn)證重組蛋白是否正確表達(dá)?SDS-PAGESizeandimmunoblottingProteolyticcleavageNativePAGEAggregationIEFHeterogeneityBiologicalactivityStabilityatdifferentpH,ionicstrengths,proteinconcentrationsdetergentconcentrationsN-termina
5、lsequencingTruncatedformsHeterogenousN-terminus11/GE/2.GST標(biāo)記融合蛋白的純化62.GST標(biāo)記融合蛋白的純化2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶2.2純化優(yōu)化2.3應(yīng)用2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶GlutathioneSepharose填料分子結(jié)構(gòu)谷胱苷肽通過(guò)環(huán)化反應(yīng)偶聯(lián)到填料的骨架上，這個(gè)配體結(jié)構(gòu)是和谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的。14/GE/7凝膠、預(yù)裝柱2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶凝膠GlutathioneSepharoseHP凝膠：是一款高效、高分辨率的，只需通過(guò)一步親和就能純化GST標(biāo)簽蛋白的凝膠。預(yù)裝柱GSTrapHP
6、Columns1ml5ml15/GE/凝膠、預(yù)裝柱2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶凝膠GlutathioneSepharose4FastFlow凝膠：是一款高流速純化GST標(biāo)簽蛋白的凝膠，比較適合放大純化。預(yù)裝柱GSTrapFFColumns1ml5mlGSTPrepFF16/10(20mlmedia)GSTMultiTrapFF(50ul/well)16/GE/8凝膠、預(yù)裝柱2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶凝膠GlutathioneSepharose4B凝膠：可以方便的純化GST標(biāo)簽蛋白，耐壓較低，流速比4FF凝膠低，載量也比4FF低。預(yù)裝柱GSTrap4BColumns1ml5mlGS
7、TMultiTrap4B(50ul/well)17/GE/酶2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶18/GE/9酶2.1產(chǎn)品-凝膠、預(yù)裝柱、酶用PreScissionprotease切除GST標(biāo)記的純化流程（可在4℃操作）3.加還原谷胱甘4.加PreScission5.用HiTrap6.再把脫鹽樣品7.收集穿肽洗脫P(yáng)rotease到洗脫液中Desalting小柱脫加到GSTrap透液切開(kāi)融合蛋白質(zhì)鹽去除還原谷胱甘FF或HP小柱肽1.加細(xì)胞裂解澄清液到GSTrapFF或HP小柱分
