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《資料一核酸分離純化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、核酸分離與純化中晶生物核酸在體內(nèi)的分部情況：DNA真核生物：細(xì)胞核：95％細(xì)胞器：5％RNA細(xì)胞質(zhì)：75％細(xì)胞核：10％細(xì)胞器：15％rRNA：80-85％，tRNA和mRNA：10-15%概述：核酸包括DNA和RNA,與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在結(jié)構(gòu)形式多樣：真核生物：染色體DNA：雙鏈線性分子原核生物基因組DNA、質(zhì)粒、真核細(xì)胞器：雙鏈環(huán)狀病毒DNA：雙鏈/單鏈環(huán)狀、雙鏈/單鏈線狀RNA：多為單鏈線性分子核酸分離純化的原則：保持其一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是研究核酸功能的最基本要求遺傳信息保存在一級(jí)結(jié)構(gòu)中一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定與其它生物大分子結(jié)合的方式排除其它分子的污
2、染純化核酸樣品應(yīng)達(dá)到的三點(diǎn)要求：無有機(jī)溶劑和過高濃度金屬離子的存在二者對酶的活性有抑制作用其它生物大分子的濃度應(yīng)該盡量低蛋白質(zhì)、多糖、脂類：影響后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)去除其它核酸的污染盡量減少DNA中RNA污染，反之亦然排除異種生物的DNA/RNA污染實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾點(diǎn)問題：減少化學(xué)因素對核酸的降解避免過酸或過堿，操作時(shí)PH值多在4-10之間減少物理因素對核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞主要是機(jī)械剪切力和高溫防止核酸的生物降解尤其是RNA抽提過程中防止RNase對RNA的降解盡量減少操作步驟，縮短提取過程減少各種負(fù)面因素對核酸的降解細(xì)胞裂解有機(jī)溶劑的萃取、去除蛋白質(zhì)及多糖定量分析核酸粗制品凝膠電泳柱
3、吸附法電透析法去除凝膠等雜質(zhì)純的核酸制品核酸分離與純化DNA分離基因組DNA分離質(zhì)粒DNA分離凝膠DNA回收PCR產(chǎn)物純化核酸抽提與分離RNA分離總RNA分離mRNA分離一、基因組DNA抽提過柱離心系列G-spinGenomicDNAKit動(dòng)物細(xì)胞/組織，血液，植物/食品、細(xì)菌EzWayGenomicDNAKit,Multi動(dòng)物細(xì)胞/組織，血液，植物/食品、細(xì)菌、病毒、酵母非過柱系列G-DEXGenomicDNAExtractionKit動(dòng)物細(xì)胞/組織，血液GenomicDNAPurificationKit:動(dòng)物細(xì)胞/組織，血液、植物、細(xì)菌G-spinGenomicDNAKit分離
4、示意圖分離原理高鹽濃度情況下，硅石與DNA結(jié)合低鹽濃度情況下，硅石與DNA分離簡要流程結(jié)合洗滌洗脫樣本數(shù)量（細(xì)胞）DNA產(chǎn)量(ug)DNA純度SNU1(Human)3million25-352.04SNU601(Human)3million25-352.0B16(Mouse)3million30-402.02HeLaCells3million27-362.0NB43million23-332.01操作時(shí)間：15-20分鐘樣本數(shù)量（mg）DNA產(chǎn)量(ug)DNA純度Spleen(Mouse)20mg22-302.01Kidney(Mouse)30mg30-402.0Liver(Mou
5、se)30mg30-402.0細(xì)胞組織EzWayGenomicDNAKit,Multi原理：同G-spinGenomicDNAkit特點(diǎn)：試劑無毒性缺點(diǎn)：價(jià)格相對IntRON貴推薦：細(xì)胞/組織、血液、植物/食品、細(xì)菌－G-spin系列酵母－EzWay系列病毒DNA/RNAmix－G-spin系列基因組DNA抽提常見問題分析(一)Q1、洗滌后硅膠膜上有雜色殘留細(xì)胞裂解不充分,裂解液和樣品要充分混勻Q2、洗脫產(chǎn)物DNA量很少或沒有A、樣品中細(xì)胞或病毒濃度低B、裂解液和樣品混合不均勻造成的細(xì)胞裂解不充分C、蛋白酶K活性下降造成的細(xì)胞裂解不充分D、溫浴時(shí)間不夠造成的細(xì)胞裂解不充分或蛋白降解
6、不完全，盡量把組織切成小塊，延長溫浴時(shí)間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。E、DNA洗脫效率低，離心柱中加入洗脫液后室溫靜置至少1min，再離心F、洗脫液pH不對，低pH值減少DNA產(chǎn)率。確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間。G、洗脫體積大，超過200μlDNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少Q(mào)3、A260/A280比值較低用水作為洗脫液時(shí)，比值偏低Q4、A260/A280比值較高大量RNA殘留，沒有使用RNaseA，或RNaseA活性下降Q5、DNA影響后續(xù)酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)A、在洗脫液中有殘留的漂洗液，可通過再次離心去除B、大量RNA殘留基因組DNA抽提常見問題分析(二)質(zhì)粒特性介紹：大腸
7、桿菌染色體DNA較質(zhì)粒DNA大得多染色體DNA為線性分子，而大多數(shù)質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉合的環(huán)狀分子宿主菌（一般是大腸桿菌株）DNA與質(zhì)粒DNA之間的兩種主要性質(zhì)差異：二、質(zhì)粒DNA抽提小量抽提GeneJETPlasmidMiniprepKit（有現(xiàn)貨）同下面產(chǎn)品類似，價(jià)格相對要貴DNA-spinPlasmidDNAExtractionKit（價(jià)格更有優(yōu)勢）所有后續(xù)分子生物學(xué)操作，包括轉(zhuǎn)染EzWayPlasmidDNAKit,Mini（價(jià)格太貴）測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、酶切
