核酸分離純化_經(jīng)典版

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1、核酸的分離純化技術(shù)核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。概述一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.意義：遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下條件及要求：1）減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解:pH4-102）減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力：0-4?C強(qiáng)烈振蕩、攪拌，細(xì)胞突置于低滲液中，細(xì)胞裂解，反復(fù)凍貯等造成的機(jī)械剪切力等條件都能明顯破壞大分子量的

2、線性DNA分子，對(duì)于分子量小的環(huán)狀質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對(duì)小一些；另外如高溫加熱，除高溫本身對(duì)核酸分子中的化學(xué)鍵的破壞作用外，還可能因煮沸帶來(lái)液體剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的條件下進(jìn)行。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性3）抑制DNase或RNase的活性：所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。4）簡(jiǎn)化步驟，縮短時(shí)間，減少破壞。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性3.DNA酶抑制劑(1）金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、檸檬酸鹽絡(luò)合Mg2+、Ca2+等

3、離子。(2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素。(1)皂土（bentonite）作用機(jī)制：皂土帶負(fù)電荷，能吸附RNase，使其失活。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體，很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。作用機(jī)制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋

4、白變性。使用注意：DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA時(shí)，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。劇毒。（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性4.RNA酶（RNAase)抑制劑（3)肝素（4）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)4.RNA酶（RNAase)抑制劑（一）保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性一、核酸分離、純化原則(二)盡量排除其它分子的污染，保證核酸樣品的純度純化的

5、核酸樣品不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑或過(guò)高濃度的金屬離子，蛋白質(zhì)、脂類、多糖分子的污染應(yīng)降低到最低程度；無(wú)其它核酸分子的污染，如提DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA分子。破碎組織細(xì)胞提取純化I.材料與方法的選擇II.破碎細(xì)胞或包膜－核酸的釋放III.核酸分離、純化IV.核酸的濃縮、沉淀、洗滌,并去除雜質(zhì)V.核酸的鑒定與保存二、分離提取核酸的主要步驟臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實(shí)驗(yàn)材料的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來(lái)確定。不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本：簡(jiǎn)便快速、安全、經(jīng)濟(jì)；應(yīng)

6、選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。（一）材料與方法的選擇臨床常見(jiàn)的標(biāo)本有血液、尿液、唾液、組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞等都可作為提取核酸的原料，具體實(shí)驗(yàn)材料的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來(lái)確定。不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本：簡(jiǎn)便快速、安全、經(jīng)濟(jì)；應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案：完整性、產(chǎn)量、純度和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。（一）材料與方法的選擇DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放破碎細(xì)胞的方法有三種：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法

7、、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞，SDS可溶解細(xì)胞膜、核膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使組織蛋白與DNA分離；③酶解法：加入溶菌酶或蛋白酶，都可使細(xì)胞膜破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸分離。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放注意：1.細(xì)胞破碎方法中機(jī)械剪切法不能用于基因組DNA的提??；2.非機(jī)械法常用化學(xué)試劑或酶細(xì)胞溶解法。（二）細(xì)胞的破碎——核酸的釋放細(xì)胞裂解物是含核酸分子的復(fù)雜混合物，核酸分子本身可能仍與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起。核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核