化學(xué)發(fā)光的原理

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1、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA),是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析儀包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí),同時(shí)發(fā)射出光子(hM),利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析)上,或酶作用于發(fā)光底物?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析儀包含兩個(gè)部分,即免疫反應(yīng)系統(tǒng)

2、和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體,當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí),同時(shí)發(fā)射出光子(hM),利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析)上,或酶作用于發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器中核心探測(cè)器件為光電倍增管（PMT），由單光子檢測(cè)并傳輸至放大器，并加高壓電流放大，放大器將模擬電流轉(zhuǎn)化為數(shù)字電流，數(shù)字電流將發(fā)光信號(hào)由R232數(shù)據(jù)線傳輸給電腦并加以計(jì)算，得

3、出臨床結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法　　化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA),是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridiniumester(AE),是有效的發(fā)光標(biāo)記物[3],其通過起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用而發(fā)光,強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成,為快速的閃爍發(fā)光(見圖1)。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析,其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無須催化劑;檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法,大分子抗原則采用夾心法,非特異性結(jié)合少,本底低;與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量,從而增

4、加靈敏度。發(fā)光酶免疫分析法　　從標(biāo)記免疫分析角度,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLEIA),應(yīng)屬酶免疫分析,只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同[5]:以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號(hào)試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP),它們有各自的發(fā)光底物。發(fā)光試劑HRP標(biāo)記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lu

5、minol),或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼),是一類重要的發(fā)光試劑。其結(jié)構(gòu)如圖4所示。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,在過氧化物酶及活性氧[過氧化陰離子(O2-),單線態(tài)氧(1O2),羥自由基(OH·),過氧化氫(H2O2)]存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體,當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光,其波長(zhǎng)為425nm?！　≡缙谟敏斆字Z直接標(biāo)記抗原(或抗體),但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標(biāo)記抗體,進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)光底物,在過氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用下,魯米諾發(fā)光,發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免

6、疫反應(yīng)物中酶的濃度。KodakAmerliteTM半自動(dòng)分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計(jì)的。增強(qiáng)發(fā)光酶增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析(enhancedluminescenceenzymeimmunoassay,ELEIA)在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑,如對(duì)2碘苯酚等,以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào),并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定,便于重復(fù)測(cè)量,從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。在全自動(dòng)分析儀上,還可通過計(jì)算機(jī)嚴(yán)密控制,進(jìn)行自動(dòng)操作,如加試劑,混合,溫育,洗滌,加發(fā)光試劑,發(fā)光計(jì)數(shù),數(shù)據(jù)處理,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,直至完成病人血清樣品的分析并打印出結(jié)果。AmerliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分

7、析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強(qiáng)劑,其發(fā)光時(shí)間可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20min,試劑盒有甲狀腺功能檢測(cè)的　　促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等?！　LP標(biāo)記的CLEIA所用底物為環(huán)1,22二氧乙烷衍生物,這是一類很有前途的發(fā)光底物,用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)——金剛烷基,其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán),在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常

8、使用的底物是AMPPD[32(2’2spiroadaman2tane)42methoxy242(3’2phosphoryloxy)2phenyl21,22dioxetane],中文名為:32(2’2螺金剛烷)242甲氧基