化學發(fā)光原理

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1、簡介上世紀70年代中期Arakawe首先報道CLIA，發(fā)展至今已經成為一種成熟的、先進的超微量活性物質檢測技術，應用范圍廣泛，近10年發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數量級，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯(lián)免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（6-18個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點。高靈敏度的化學發(fā)光檢測技術以被廣大研究人員所認可，并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測技術。化學發(fā)光與放射免疫

2、法是公認的腫瘤標志物和各種激素最精確和最成熟的檢測方法，二者的原理、技術與方法早已成熟并被國外各大醫(yī)院用于腫瘤檢測和激素檢測，二者的試劑與儀器均通過美國FDA認證與我國藥監(jiān)局的批準。但是，放射免疫分析法雖有很高的靈敏度，卻存在放射性防護和同位素污染的問題，況且試劑價格昂貴只有一個有保質期，在基層醫(yī)療機構難以普及?；瘜W放光免疫分析儀繼承了放射免疫的所有優(yōu)點，同時克服了放射免疫和酶聯(lián)免疫各自的缺點，是臨床免疫檢測最理想的新方法?？梢钥隙ǖ恼f，她將取代放射免疫和酶聯(lián)免疫成為臨床免疫檢測最理想的新技術。[1]2原理化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分

3、,即免疫反應系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。化學發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發(fā)態(tài)的中間體,當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時,同時發(fā)射出光子(hM),利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質(在反應劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原(化學發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學發(fā)光分析)上,或酶作用于發(fā)光底物。3類型化學發(fā)光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種:(1)化學發(fā)光標記免疫分析法;(2)酶標記、以化學發(fā)光底物作信號試劑的化學發(fā)光酶免疫分析法化學發(fā)光標記免疫分析化學發(fā)光標記免疫

4、分析又稱化學發(fā)光免疫分析(CLIA),是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物——acridiniumester(AE),是有效的發(fā)光標記物[3],其通過起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用而發(fā)光,強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內完成,為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析,其化學反應簡單、快速、無須催化劑;檢測小分子抗原采用競爭法,大分子抗原則采用夾心法,非特異性結合少,本底低;與大分子的結合不會減小所產生的光量,從而增加靈敏度?；瘜W發(fā)光酶免疫分析從標記免疫分析角度,化學發(fā)光酶免疫分

5、析(chemiluminescentenzymeimmunoassay,CLEIA),應屬酶免疫分析,只是酶反應的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同[5]:以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應,免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號試劑作用下發(fā)光,用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP),它們有各自的發(fā)光底物。HRP標記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,luminol),或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼),是一類重要的發(fā)

6、光試劑。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行,在過氧化物酶及活性氧[過氧化陰離子(O2-),單線態(tài)氧(1O2),羥自由基(OH·),過氧化氫(H2O2)]存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體,當其回到基態(tài)時發(fā)光,其波長為425nm。早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體),但標記后發(fā)光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體,進行免疫反應后利用魯米諾作為發(fā)光底物,在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用下,魯米諾發(fā)光,發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。KodakAmerliteTM半自動分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設計的。增強

7、發(fā)光酶免疫分析(enhancedlumines2cenceenzymeimmunoassay,ELEIA)在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑,如對2碘苯酚等,以增強發(fā)光信號,并在較長時間內保持穩(wěn)定,便于重復測量,從而提高分析靈敏度和準確性。在全自動分析儀上,還可通過計算機嚴密控制,進行自動操作,如加試劑,混合,溫育,洗滌,加發(fā)光試劑,發(fā)光計數,數據處理,繪制標準曲線,直至完成病人血清樣品的分析并打印出結果。AmerliteTM發(fā)光增強酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強劑,其發(fā)光時間可持續(xù)長達20min,試劑盒有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲

8、腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。ALP標記的CLEIA所用底物為環(huán)1,