精子質(zhì)量評價

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1、精子質(zhì)量評價規(guī)程一、原理與意義精子活力、精子存活率和精子計數(shù)是評價精子質(zhì)量的三個主要指標(biāo)。剖殺雄性動物，取單側(cè)附睪，在預(yù)熱的培養(yǎng)液中剪碎，孵育一定時間后，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。精子活力：先計數(shù)a級（快直線運(yùn)動，≧25um/s，即大于5個精子頭）和b級(慢直線運(yùn)動，5～24um/s，即小于5個精子頭)，再計數(shù)c級（原地打轉(zhuǎn)或運(yùn)動遲緩，≦5um/s）和d級（無活力）用血球計數(shù)板進(jìn)行精子計數(shù)。精子存活率：用伊紅染液和精子懸液混勻后，觀察活精子（頭部白色）和死精子（頭部紅色）分別所占比例。精子計數(shù)：用精子固定液和精子懸液混勻后，觀察紅細(xì)胞計數(shù)區(qū)域（25格，每格含有16

2、小格）至少5大格（周邊4格＋中間1格）的精子總數(shù)。二、試劑及其配制1、含0.1％BSA(小牛血清蛋白)的F12培養(yǎng)液（4℃保存，用前限量預(yù)熱，當(dāng)日現(xiàn)配,無菌操作,當(dāng)變色后不可再用）。2、精子固定液（50gNaHCO3＋36～40%甲醛溶于雙蒸水至1000ml，4℃保存）3、0.67％伊紅染液（0.67g伊紅＋0.9gNaCl溶于100ml雙蒸水，常溫下保存，用前限量預(yù)熱）。三、儀器設(shè)備光學(xué)顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板、計數(shù)器、定時器、擦鏡紙、紗布、蓋玻片(20mm×20mm)、載玻片、水浴鍋、剪刀、鑷子、一次性吸管、離心管、移液器、槍頭等。四、操作步驟本實驗分為三

3、個部分：精子活力、精子存活率、精子計數(shù)。這三個部分要按一定時間順序操作。操作順序：殺死動物，取下單側(cè)附睪（快速）→放入37℃預(yù)熱的含3mlF12培養(yǎng)液的小燒杯中，剪碎（精子充分釋放）→37℃孵育5min后，精子計數(shù)檢查→再加入2mlF12培養(yǎng)液，37℃再孵育5min后，精子活力檢查→同時再孵育5min～10min（可調(diào)整）立刻進(jìn)行精子存活率檢查。4具體操作：1、精子計數(shù)檢查（1）取單側(cè)附睪，放入預(yù)熱的含3mlF12培養(yǎng)液的小燒杯中，剪碎；（2）37℃孵育5min后，用剪頭的一次性吸管充分將燒杯內(nèi)液體混勻（重要），在小管中按1:1加入50ul精子懸液和50u

4、l精子固定液，充分混勻；（3）加6ul入計數(shù)池一側(cè)，將計數(shù)板放入濕盒中10min（可調(diào)整）；（4）在16×10倍鏡下，紅細(xì)胞計數(shù)區(qū)域（25格，每格含有16小格）至少觀察5大格（周邊4格＋中間1格）。其中，精子頭部在雙線最左和最上處計數(shù)，而精子頭部在雙線最右和最下處不計。只有精子頭部沒有尾部計，只有精子尾部沒有頭部不計。2、精子活力檢查（1）精子計數(shù)取出50ul精子懸液后，再在燒杯中加入2mlF12培養(yǎng)液，37℃再孵育5min，用吸管充分混勻后，加6ul入預(yù)熱計數(shù)池一側(cè);（2）立即在16×10倍鏡下觀察，在白細(xì)胞計數(shù)區(qū)域（紅細(xì)胞計數(shù)區(qū)外圍，分四個區(qū)，每區(qū)12

5、格）任選九格（剛好在鏡下包括的視野）迅速計數(shù)，先計數(shù)a級（快直線運(yùn)動，≧25um/s，即大于5個精子頭）和b級(慢直線運(yùn)動，5～24um/s，即小于5個精子頭)；再計數(shù)c級（原地打轉(zhuǎn)或運(yùn)動遲緩，≦5um/s）和d級（無活力）。3、精子存活率檢查（1）精子活力取出6ul精子懸液后，再孵育5min～10min（時間可調(diào)整）；（2）在載玻片上加入預(yù)熱的0.67％伊紅染液6ul，再加入6ul精子懸液，在玻片上用移液器混勻；（3）蓋上蓋玻片，快速讀片，可在高倍鏡40×16倍鏡下同時計數(shù)死/活精子。白色的為活精子，紅色的為死精子。一、結(jié)果計算與評價1、精子計數(shù)檢查紅細(xì)

6、胞計數(shù)板上最小的方格=1/4000mm3，1mL=103mm3最終檢測紅細(xì)胞計數(shù)板五個大方格，每個大方格含16個小方格，共計數(shù)80個小方格。則：兩側(cè)附睪總精子數(shù)為（個/ml）=4×106×（五格精子數(shù)/80）×2（兩側(cè)附睪）42、精子活動力檢查記錄a級、b級、c級和d級的數(shù)目，分別計算(a+b+c)/(a+b+c+d)和a/(a+b+c+d)的值。3、精子存活率檢查記錄死精子和活精子的數(shù)目，計算活精子/（活精子+死精子）的值。一、注意事項1、本實驗采用盲法。參與讀片的人員在實驗過程中不能知道實驗動物的分組情況，否則會對實驗有主觀性的影響。2、培養(yǎng)液即用即配

7、。如果顏色發(fā)生改變和出現(xiàn)絮狀物，即要棄去。3、操作要快。如取附睪、活力的讀數(shù)和存活率的讀片等。4、制片：一定要將精子懸液和混合液充分混勻，再從中吸出，吸取時盡量不要吸到組織碎片。5、各項指標(biāo)均由兩人平行讀片：同一樣品分別制備兩份不同的片子，隨后可以取均數(shù)統(tǒng)計，若發(fā)現(xiàn)制片不均勻則需重新制片。這可避免讀數(shù)誤差和制片誤差。6、精子活力：特別是a和b都應(yīng)該快速讀數(shù)，一定要最短時間內(nèi)讀完，從第一個格開始到第二格一直到最后的格子，讀每格的時間應(yīng)該固定，每讀到下一格上一格通過的精子數(shù)都不要再計數(shù)，若為兩人讀片應(yīng)該統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)選擇精子數(shù)較為平均的視野，如果有一兩個成團(tuán)的精

8、子，則避開不數(shù)，如果成團(tuán)多而大影響讀數(shù)，則應(yīng)該重新制片。7、精子存