穩(wěn)定細(xì)胞系建立學(xué)習(xí)

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1、中國生物工程雜志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（５）：１７～２２ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及特性研究張巨程杰陳靜易娟孫靜魏虎來（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心蘭州７３００００）摘要將已構(gòu)建好的含有人多藥耐藥（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）全長基因的真核表達(dá)質(zhì)粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１，應(yīng)用脂質(zhì)體導(dǎo)入人肝癌ＨｅｐＧ２細(xì)胞，應(yīng)用Ｇ４１８篩選出人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１。通過對ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察和生物學(xué)特性的研究，成功地建立了高效、穩(wěn)定的ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１細(xì)胞系；為深入研究肝癌的ＭＤＲ

2、及其逆轉(zhuǎn)提供了理想的細(xì)胞模型，并為探索建立肝癌ＭＤＲ細(xì)胞株提供新的方法和思路，同時(shí)為研究肝癌細(xì)胞胰島素抵抗與ＭＤＲ的關(guān)系提供了模型細(xì)胞。關(guān)鍵詞多藥耐藥人肝癌ＨｅｐＧ２細(xì)胞轉(zhuǎn)染ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１重組質(zhì)粒中圖分類號Ｑ８１３肝癌的綜合治療中化療是目前最重要的方法之ＡＤＭ）為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；Ｔｒｉｚｏｌ為［１．２］一，但多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生是影響其療效的瓶頸。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司產(chǎn)品；ＡＭＶ、ＰＣＲ試劑盒、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ研究表明，在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)理中，ｍｄｒ１基因及兩步法ＲＴ?ＰＣＲ實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ其產(chǎn)物Ｐ?糖

3、蛋白（Ｐ?ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐ?ｇｐ）過度表達(dá)是最主購自ＴａＫａＲａ公司；ｍｄｒ１、β?ａｃｔｉｎ引物由ＴａＫａＲａ公司合要的因素之一。研究表明，抑制ｍｄｒ１基因的表達(dá)可提成。其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。［３］高耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性，同時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)胰１．２方法［４］島素抵抗的肝癌細(xì)胞ｍｄｒ１／Ｐ?ｇｐ表達(dá)增高。藉此，本１．２．１ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１重組質(zhì)粒的提取與純化用攜帶研究將攜帶人類全長ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＣＩ?有人類全長ｍｄｒ１ｃＤＮＡ重組表達(dá)質(zhì)粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１轉(zhuǎn)ｎｅｏ?ｍｄｒ１轉(zhuǎn)入人肝癌ＨｅｐＧ２細(xì)胞，成功地篩選出高

4、效、化感受態(tài)細(xì)胞ＪＭ１０９后，涂布在含有氨芐青霉素的ＬＢ穩(wěn)定且耐藥機(jī)理明確的多藥耐藥細(xì)胞株ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１，平板上，挑取單個(gè)的陽性菌落接種于含有氨芐青霉素并測定了其生長曲線、ｍｄｒ１ｍＲＮＡ和Ｐ?ｇｐ的表達(dá)及Ｐ?的ＬＢ中，震蕩培養(yǎng)過夜。提取、純化質(zhì)粒，經(jīng)ＰＣＲ鑒定ｇｐ的功能等生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究肝癌細(xì)胞耐藥為陽性，并測定其濃度的質(zhì)粒溶液置于－２０℃?zhèn)溆谩C(jī)制及其逆轉(zhuǎn)，以及肝癌細(xì)胞胰島素抵抗與Ｐ?ｇｐ的關(guān)１．２．２ＨｅｐＧ２細(xì)胞的培養(yǎng)及ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１的轉(zhuǎn)染復(fù)蘇系提供理想的細(xì)胞模型。后的ＨｅｐＧ２細(xì)胞轉(zhuǎn)于含１０％新生牛血清的低糖ＤＭＥＭ完１材料與方法

5、全培養(yǎng)基中，在３７℃、５％ＣＯ２、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周傳代２～３次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。１．１材料轉(zhuǎn)染前１ｄ，取生長狀態(tài)良好的ＨｅｐＧ２細(xì)胞，常規(guī)１．１．１重組質(zhì)粒與細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株ＨｅｐＧ２細(xì)胞消化后，用無抗生素的完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為１×由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存，攜帶有人類全長ｍｄｒ１６１０單細(xì)胞懸液，在６孔板中每孔加入２ｍｌ細(xì)胞懸液，ｃＤＮＡ的重組質(zhì)粒ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１由四川大學(xué)醫(yī)學(xué)中心置于３７℃、５％ＣＯ的孵箱中培養(yǎng)過夜，當(dāng)孔內(nèi)貼壁細(xì)構(gòu)建和惠贈(zèng)。２１．１．２試劑ＬｉｐｏｆｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、質(zhì)粒提取胞達(dá)到９０％

6、～９５％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在加入脂質(zhì)體包被的試劑盒購自北京天根公司；羅丹明１２３（Ｒｈ１２３）、低糖ＤＮＡ前２ｈ，６孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基繼ＤＭＥＭ培養(yǎng)基購自Ｓｉｇｍａ公司；阿霉素（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，續(xù)培養(yǎng)。在待轉(zhuǎn)染的ＨｅｐＧ２細(xì)胞孵育期間，用ｐＨ７．２的ＤＭＥＭ分別將４μｇ的ｐＣＩ?ｎｅｏ?ｍｄｒ１和１０μｌ的脂質(zhì)收稿日期：２００８１１１３修回日期：２００８１２１１通訊作者，電子信箱：ｗｅｉｈｕｌａｉ＠ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ體（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）各稀釋至２５０μｌ，輕柔混合后，室溫下１８中國生物工程雜志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ

7、ｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．５２００９靜置２０ｍｉｎ，形成脂質(zhì)體／ＤＮＡ混合物后。按比例依次ｍｄｒ１ｍＲＮＡ的表達(dá)變化分別收集對數(shù)生長期的第加入６孔板的相應(yīng)孔內(nèi)，輕輕搖晃混勻后。于３７℃孵２０代ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１及對照ＨｅｐＧ２細(xì)胞，Ｔｒｉｚｏｌ提取總育２４ｈ后，消化傳代。ＲＮＡ。以β?ａｃｔｉｎ為內(nèi)參、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ為指示劑，利用１．２．３ＨｅｐＧ２／ｍｄｒ１細(xì)胞的篩選與傳代將上述轉(zhuǎn)染所設(shè)計(jì)的引物（ｍｄｒｌ引物的上、下游序列分別為：５′?后的細(xì)胞消化傳代于含１５％血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)ＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧ?３′和５′?ＧＴＴＣＡＡ２４ｈ后，即

8、轉(zhuǎn)染后的第