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《穩(wěn)定表達(dá)T7RNAP的BHK_21細(xì)胞系的建立》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第32卷第6期中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報Vol.32，No.62010年6月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineJun.2010穩(wěn)定表達(dá)T7RNAP的BHK-21細(xì)胞系的建立1,2111112*11*李欣，楊少華，王洪梅，劉曉，武建明，高運(yùn)東，王立群，仲躋峰，何洪彬(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東濟(jì)南250100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)摘要：為建立能穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21細(xì)胞系以研究RNA重組
2、疫苗，本研究從BL21(DE3)大腸桿菌中擴(kuò)增T7RNAP基因，定向克隆于質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒pcDNA3.1-T7RNAP。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，經(jīng)G418篩選14d后獲得陽性細(xì)胞株。RT-PCR和westernblot檢測結(jié)果表明，建立了穩(wěn)定表達(dá)T7RNAP的BHK-21細(xì)胞系，并且在不同代次的陽性細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)目的基因和蛋白，該研究為RNA病毒感染性質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄及病毒拯救技術(shù)平臺的建立奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：T7RNAP；BHK-21細(xì)胞中圖分類
3、號：Q814文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0589(2010)06-0473-03EstablishmentofBHK-21celllinesstablyexpressingT7RNAP1,211111LIXin,YANGShao-hua,WANGHong-mei,LIUXiao,WUJian-ming,GAOYun-dong,2*11*WANGLi-qun,ZHONGJi-feng,HEHong-bin(1.TheResearchCenterofDairyCow,ShandongAcademyofAg
4、ricultralScience,Jinan250100,China;2.CollegeofLifeScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)Abstract:ToestablishthecelllinewithstableexpressionofT7RNApolymerasegene,T7RNAPgenewasamplifiedfromE.coliBL21(DE3)andinsertedintopcDNA3.1(+)vectort
5、oconstructrecombinantplasmidpcDNA-T7RNAP.TheBHK-21celllinestablyexpressingT7RNAPwasgeneratedbypcDNA-T7RNAPtransfectionandthepositivecellcloneswereobtainedaftercontinuallyscreeningusingG418.TheexpressionsofT7RNAPgenewereconfirmedbyRT-PCRandwesternblot.Thece
6、lllinestablyexpressingtheT7RNAPgenecouldprovideaplatformforrescueRNArecombinantvirusinvitroviareversegenetictechnique.Keywords:T7RNAP;BHK-21stablecelllines;reversegenetictechniqueT7RNA聚合酶(T7RNApolymeraseenzyme，本研究利用基因克隆及重組技術(shù)，構(gòu)建了T7T7RNAP)是一種依賴DNA的RNA聚合酶，其編碼
7、RNAP重組pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞[1]基因長度為2652bp。該酶是1個單體酶，可特異后，經(jīng)G418篩選，獲得了具有G418抗性的性識別T7啟動子，在沒有其它蛋白因子的協(xié)助下，BHK-21細(xì)胞系；經(jīng)RT-PCR及WB檢測表明，[2-5]就能介導(dǎo)T7噬菌體晚期基因轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行。G418抗性的BHK-21細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)T7RNAPT7RNAP和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄單元在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，以實現(xiàn)mRNA及蛋白。該細(xì)胞系為依靠T7RNAP體內(nèi)轉(zhuǎn)錄[6-8]病毒的體內(nèi)拯救。系統(tǒng)建立的RNA病毒反向遺傳技
8、術(shù)平臺提供了技*Correspondingauthor收稿日期：2009-10-12基金項目：國家轉(zhuǎn)基因重大專項(2009ZX08007-006B)；山東省自然科學(xué)基金(Y2008D20)；山東農(nóng)科院“杰出人才”基金；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題；山東省科技攻關(guān)項目作者簡介：李欣(1982-)，女，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究.*通信作者：E-mail：wangliqun2@163.com；
