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《p53基因表達(dá)沉默的穩(wěn)定Vero細(xì)胞系的建立及特性分析》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、生物技術(shù)通報(bào)·研究報(bào)告·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2010年第7期p53基因表達(dá)沉默的穩(wěn)定Vero細(xì)胞系的建立及特性分析劉超邱亞峰沈陽劉慶偉馬志永(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室,上海200241)摘要:利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),建立穩(wěn)定沉默p53基因的Vero細(xì)胞模型。設(shè)計(jì)針對(duì)p53基因的shRNA序列,構(gòu)建p53shRNA慢病毒載體并感染Vero細(xì)胞;嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞,局部消化法挑選細(xì)胞克隆;利用RT-PCR和West-ernblot檢測(cè)p53的表達(dá)水平;利用蟲熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),分析p53的轉(zhuǎn)錄激
2、活功能。RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示,慢病毒介導(dǎo)的shRNA有效地沉默p53基因表達(dá);與對(duì)照組細(xì)胞相比,干擾組細(xì)胞的p53的轉(zhuǎn)錄激活功能明顯降低。慢病毒介導(dǎo)的shRNA高效、穩(wěn)定地沉默了p53基因的表達(dá),同時(shí),有效地降低了p53的轉(zhuǎn)錄激活功能,為研究p53的生物學(xué)功能提供了有利的工具。關(guān)鍵詞:p53慢病毒載體RNA干擾篩選細(xì)胞系GenerationandCharacteristicAnalysisofaStableVeroCellLinewithp53GeneExpressionKnocked-downUsingLentivi
3、ralVector-mediatedShortHairpinRNALiuChaoQiuYafengShenYangLiuQingweiMaZhiyong(LaboratoryofVeterinaryPublicHealth,ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai200241)Abstract:ThestudywastoestablishastableVerocelllinewithp53genesilencingusin
4、glentivirus-mediatedRNAinterference(RNAi).VerocellswereinfectedwitharecombinantlentivirusexpressingaspecificshRNAforp53gene.ThepositivecellcloneswereselectedusingselectivedrugofPuromycin,andisolatedusingthemethodofpartialdigestion.Theexpressionofp53wasdetectedbysemi-quantit
5、ativeRT-PCRandWesternblot.Thep53transcriptionactivityofthenegativecontrolandp53RNAiVerocellswasana-lyzedwithaluciferasereportsystem.TheVerocelllinewithp53genesilencingwasobtained.Theanalysisofsemi-quantitativeRT-PCRandWesternblotshowedthattheexpressionofp53wassubstantiallyd
6、own-regulatedbyRNAi.Thep53transcriptionalactivityinRNAicellswassignificantlydecreasedcomparedwiththatinnegativecontrolcells.Theresultsdemonstratedthatthelentiviralvector-media-tedshorthairpinRNAhaseffectivelyandspecificallysilencedp53geneexpressionandconsequentlydown-regula
7、tedthep53transcrip-tionalactivityinthegenerated-p53RNAiVerocellline.ThisRNAicelllinewasappearedtobeausefultoolinstudyingthebiologicalfunctionofp53.Keywords:p53LentivirusvectorRNAinterfereScreeningCellline[2]在各種動(dòng)物細(xì)胞中,p53基因具有非常相似的路非常復(fù)雜,具有參與細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞分化[3][4]基因結(jié)構(gòu),長(zhǎng)約20kb,都由11個(gè)外顯
8、子和10個(gè)內(nèi)與衰老,DNA修復(fù)與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種生物[1]含子組成。而p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通學(xué)功能。收稿日期:2010-03-15基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基