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《紅海欖脫水素基因(RsDHN1)克隆及表達(dá)分析》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第31卷第5期熱帶作物學(xué)報V0】．3lNo．52010年5月CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPSMay．2010紅海欖脫水素基因(RsDHN1)的克隆及表達(dá)分析馬宏偉，徐遠(yuǎn)峰，翟金玲，陳旭峰，黃惜霉海繁南大學(xué)蒂生物科擎學(xué)磊技術(shù)研究所海礙南海礙口，570228摘要采用RT—PCR和RACE技術(shù)對已獲得的紅海欖根部其中一個差異表達(dá)基因進(jìn)行克?。ㄟ^Blast分析和序列比對可知，該基因全長cDNA序列包括146bp的5端非編碼區(qū)，43bp的3端非編碼區(qū)和一個編碼241個氨基酸的開放閱讀框．命名為RsDHN1基因該cD
2、NA編碼的蛋白具有植物脫水素蛋白的特征性結(jié)構(gòu)，屬于SKn類脫水索蛋白．與其它植物的SKn類脫水素蛋白具有43％55的氨基酸序列同源性。半定量RT—PCR分析表明。鹽脅迫對RsDHN1基因的表達(dá)有明顯上調(diào)作用關(guān)鍵詞紅海欖；脫水素：RACE；耐鹽基因doi10．3969~．issn．1000—2561．2010．05．020中圖分類號Q785．978620世紀(jì)以來，世界人El迅速膨脹，耕地面積由于鹽堿化、全球氣候變暖、沙漠化及工業(yè)區(qū)域擴(kuò)展、城鎮(zhèn)建設(shè)加快等因素而快速減少．使有限的耕地與水資源面臨一場新的危機(jī)。中國目前有未開發(fā)的鹽堿化土壤5
3、．2億畝．這些鹽堿地是人類未來潛在的耕地。目前，人類耕種的絕大部分作物都缺少耐鹽性，探索植物耐鹽機(jī)制．提高植物耐鹽性，開展耐鹽作物分子育種，對減輕人類所面臨的土地資源、淡水資源、糧食供需的矛盾以及有效控制環(huán)境惡化具有重要的戰(zhàn)略意義l】1自然界經(jīng)過長期仁存競爭．自然選擇和優(yōu)勝劣汰．存留下大量耐鹽植物資源．這些耐鹽植物是開展植物耐鹽機(jī)制研究的重要材料和基因庫資源。紅樹林植物長期生長在高鹽、高滲透壓下的海水環(huán)境中，已進(jìn)化出一套有別于陸生植物或淡水生植物的耐鹽機(jī)制，屬于真正的鹽生植物l2l。紅海欖(Rhizophorastylosa)是這類
4、植物中比較典型的一種，它屬于紅樹科(Rhizophorace)紅樹屬(Rhiz0ph0ra)，耐鹽優(yōu)勢明顯，是研究植物耐鹽機(jī)制的理想材料[31。為了克隆紅海欖的耐鹽相關(guān)基因．筆者在前期試驗(yàn)中構(gòu)建了紅海欖cDNA文庫，將紅海欖幼苗分別進(jìn)行淡栽和鹽栽處理。通過基因芯片分析在其根部差異表達(dá)基因，找到了一些有明顯差異表達(dá)的cDNA片段。本文采用RT—PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆了其中一個差異表達(dá)片段的全長cDNA序列．通過Blast分析和序列比對．將之鑒定為脫水素基因，命名為RsDHN1：用半定量RT—PCT分析鹽脅迫對
5、其表達(dá)的影響．為進(jìn)一步研究該基因的功能和鑒定紅海欖的耐鹽機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1．1材料紅海欖(Rhizophorastylosa)，采自海南東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)。菌種EscherichiacoliDH5a本實(shí)驗(yàn)室保存。SuperscriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒購自Invitrogen公司；TaKaRaLAPCRTMKitVer．2．1購自大連寶生物有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、DNA聚合酶等購自TIANGEN公司；T4一DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等分子生物學(xué)試劑購自Fermentas公司：其它生化試劑為國產(chǎn)分析純。引物
6、合成和DNA測序資助項目：人力資源與社會保障部2008年度高層次留學(xué)人才回國工作資助項目，海南大學(xué)2009年度科研項目(hd09xm60)，海南自然科學(xué)基金項目(808109)資助。第一作者簡介：馬宏偉，男，1984年生，山西人，碩士研究生。研究方向：作物遺傳育種。E-mail：a123tianma@163．con。通訊作者，黃惜，E-mail：xihuangO1@gmail．corn；Tel：0898—66279271。收稿13期：2010—03—15修回日期：2010—04—215期馬宏偉等：紅海欖脫水素基因(RsDHN1)的克
7、隆及表達(dá)分析805均由上海生工生物技術(shù)有限服務(wù)公司(簡稱上海生工)負(fù)責(zé)完成。eDNA合成CDSm／3PCRPrimer：5一ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG—d(T)30N．1N一3(N=A、G、C或T；N．1=A、G或C)，SMARTIVOligo(dT)：5一AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGC-CATTACGGCCGGG一3。特異弓I物，5RACE，RsDHN5"out：5一GGAGCGGCTI"GATCTY一3：RsDHN5in：5一TGTCCTCCTGGCAGTF一3。1．2方法1．2
8、_1紅海欖葉片總RNA的提取采用改良的CTAB法提取紅海欖葉片總RNA在液氮下研磨葉片．取約5g葉片粉末加到預(yù)先預(yù)熱的15mL提取緩沖液中，再加入15mL體積比為25：24：1的苯酚：氯仿：異戊醇，充分混勻，冰浴15min；4℃下12
