部分核酸的制備分離、純化

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1、第一部分核酸的制備（分離、純化）核酸的制備（分離、純化）一、總論二、以質(zhì)粒DNA為例談DNA的分離純化三、以真核生物為代表介紹總RNA的純化四、核酸的進(jìn)一步純化（聚乙二醇、氯化銫梯度離心問題：分離核酸的基本依據(jù)、方法？核酸分離主要需要注意的是什么？DNA和RNA分離時的主要差別？不同的生物體中，核酸所處的環(huán)境不盡相同：1、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密程度不同。2、DNA與RNA含量有差別。3、核酸分子量大小有差別。4、…..由于核酸性質(zhì)基本相同，生物體所組成的成分基本相同，因此，對于不同的生物體核酸的分離方法相差不大。

2、以上是常見核苷酸結(jié)構(gòu)，中性PH下的離子狀態(tài)的鈉鹽形式。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)是分離的基礎(chǔ)。核酸的結(jié)構(gòu)特點：分子巨大，有共扼雙鍵、氫鍵、苷鍵、和磷酸二酯鍵，自由氨基、磷酸基。核酸的二級結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；RNA大多為單鏈，鏈的許多區(qū)域或自身發(fā)生回折，回折區(qū)內(nèi)的多核苷酸段呈螺旋結(jié)構(gòu)。核酸性質(zhì)—核酸性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)和組分是密切相關(guān)的分子量大?。篟NA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106或者更大。DNA分子量1.6×106-2.2×109。性狀和溶解度：DNA多為白色纖維狀固體。RNA為白色粉末。都微溶于水，

3、他們的鈉鹽在水中溶解度較大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有機溶劑（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光譜：具有共扼雙鍵的嘌呤和嘧啶，故皆具有獨特的紫外吸收光譜。核酸在240-260nm的紫外波段有強烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通過OD260/OD280的比值可判斷樣品的純度。純DNA的OD260/OD280=1.8，純RNA的OD260/OD280=2.0。核酸中若含雜蛋白或苯酚則比值明顯降低。對于純核酸樣品只要讀出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260=50ug/ml

4、（雙螺旋DNA）、1OD260=40ug/ml（單螺旋DNA或RNA）、1OD260=20ug/ml（寡核苷酸）。變性：加熱、強酸堿或射線及一切可破壞核酸分子氫鍵的處理。變性后的核酸理化性質(zhì)、生物功能都會有顯著變化，最重要表現(xiàn)為粘度下降。降解：酸、堿、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。分離核酸共同要考慮的防止核酸變性與降解：①低溫操作。②分離過程需加入必要的核酸解聚酶的抑制劑（如：乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸鹽、皂土、8-羥基喹啉、SDS、苯酚等）脫蛋白：在生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合以核蛋白形式存在，核酸所處

5、的任何生物環(huán)境都含有蛋白質(zhì)，所以在核酸純化過程中需使用脫蛋白劑。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白質(zhì)降解或變性，達(dá)到與核酸分離的目的。DNA和RNA的分離：1、利用DNA和RNA在不同鹽濃度下，溶解度不同進(jìn)行分離（DNA在1-2M時溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低鹽濃度0.14M時溶解度大，DNA小。）2、通過使用DNA或RNA酶，達(dá)到DNA和RNA分離的目的。3、根據(jù)分子量不同，進(jìn)行梯度離心，進(jìn)行分離。核酸的收集：多用乙醇、異丙醇質(zhì)粒DNA純化細(xì)菌培養(yǎng)從LB瓊脂扳上挑取一個單菌落。接種到含有適

6、當(dāng)抗生素的20ml液體LB中。37℃搖床培養(yǎng)過夜（OD＝0.6）。將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入500ml含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中。37℃300rpm約3～4hr（OD=0.4）。加入2.5ml氯霉素（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170ug/ml。300rpm37℃繼續(xù)培養(yǎng)12～16hr。離心4℃4000rpm15min。棄上清。將細(xì)菌沉淀重懸于100ml預(yù)冷的STE中。離心4℃4000rpm15min。棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞。LB培養(yǎng)基Trypone10gYeastextract5gNaCl10g加水至1LSTE：

7、0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.CL（PH8）1mmol/LEDTA（PH8）1、酚提取法：將收獲的細(xì)胞重懸在20ml含20％蔗糖的TES中。加入新鮮配制的溶菌酶到終濃度為1mg/ml（枯草桿菌和大腸桿菌）或5mg/ml（蘇蕓金桿菌）。37℃保溫30—90分鐘，原生質(zhì)游離出來。向原生質(zhì)溶液中加8％SDS20ml和5MNaCl10ml。68℃保溫5min。將溶液儲于4℃冰箱，8hr以上或過夜。取出后，立即在4℃離心18000rpm,30min。取上清。向上清中加入等體積的重蒸酚（PH6—7），輕

8、搖。置冰箱15min，離心取水相。重復(fù)一次。再用等體積的氯仿—異戊醇（24：1）抽提1—2次。離心取水相。加入等體積的乙醚抽提1—2次。向水相加兩倍體積95％冷乙醇。－20℃過夜或－70℃半小時。離心15000rpm,20min,沉淀DNA。75％的乙醇洗滌一次，室溫或真空干燥。沉淀溶于PH8的TE緩沖液中。2、堿裂解法將細(xì)菌沉淀重懸于10mlSlution1中。加入1ml新配制的溶菌