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1、核酸的分離純化主要內(nèi)容前言1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.2.防止核酸的生物降解2分離提取核酸的主要步驟2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去除2.3核酸的沉淀2.4核酸的濃度測(cè)定2.5核酸的保存核酸(nucleicacid)是遺傳信息的攜帶者,是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究,首先需要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。前言Home1核酸分離、純化原則1.1保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性1.1.1意義:遺傳信息全部?jī)?chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中,核酸的—級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高
2、級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。1.1.2分離核酸原則:1)溫度不要過高;2)控制pH值范圍(pH值5-9);3)保持一定離子強(qiáng)度;4)減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力.Home1.2防止核酸的生物降解細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵,破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌,提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。1.2.1DNA酶抑制劑(1)金屬離子螯合劑:DNA酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活,因此使用金屬二價(jià)離子螯合劑,可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉;
3、(2)陰離于型表面活性劑:如SDS,該試劑除對(duì)核酸酶有抑制作用外,還能使蛋白質(zhì)變性,并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物,該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。1.2.2RNA酶(RNAase)抑制劑RNAase分布廣泛,極易污染樣品,而且耐高溫、耐酸、耐堿,不宜失活。(1)皂土(bentonite)作用機(jī)制:皂土帶負(fù)電荷,能吸附RNase,使其失活。(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液體,很強(qiáng)的核酸酶抑制劑。作用機(jī)制:與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意:1)DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度
4、比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100~1000倍。2)容易降解,保存在4℃或液氮中;3)提RNA時(shí),0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。4)劇毒。(3)肝素(4)復(fù)合硅酸鹽(Macaloid)(5)RNase阻抑蛋白(RNasin)(6)氧釩核糖核苷復(fù)合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)Home(1)高速組織搗碎機(jī)搗碎(2)玻璃勻漿器勻漿(3)超聲波處理法(4)液氮研磨法(5)化學(xué)處理法(SDS、LDS,吐溫80等)(6)生化法(溶菌酶、纖維素酶等)Home2.1細(xì)胞的破碎2.2核蛋白的解聚、變性蛋白的去
5、除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開,同時(shí)避免核酸降解。2.2.1加入濃鹽溶液(如NaCl)核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后,破壞靜電吸力,使氫鍵破壞,核蛋白解聚;2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外,還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來(lái)的功能;2.2.3酚/氯仿抽提酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果,并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大,能加速有機(jī)相與水相分層,減少殘留在水相中的酚,同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿
6、抽提核酸提取液時(shí),需要振搖,為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離,再加上一定量的異戊醇(酚:氯:異戊醉=25:24:1)。(1)使用注意酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶,如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色,表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物,例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn),因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。(2)安全操作酚腐蝕性很強(qiáng),并可引起嚴(yán)重的灼傷,操作時(shí)應(yīng)戴手套。使用酚時(shí)應(yīng)注意Home2.3核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優(yōu)點(diǎn):①改變核酸的溶解緩沖液;②重新調(diào)整核酸的濃度;③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。2.3.1核酸沉淀的鹽類及濃度鹽貯存
7、液濃度(mol/L)終濃度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時(shí),核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài),它與1價(jià)或2價(jià)陽(yáng)離子形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶解,也不會(huì)被有機(jī)溶課劑變性。2.3.2有機(jī)沉淀劑(1)乙醇優(yōu)點(diǎn):對(duì)鹽類沉淀少,沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去,不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn):需要量大,一般要求低溫操作。(2)異丙醇優(yōu)點(diǎn):需體積小,速度快,適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn):易使鹽類
8、、蔗糖與DNA共沉淀.異丙醇難以揮發(fā)除去。所以,最后用70%乙醇漂洗數(shù)次。(3)聚乙二醇(PEG)優(yōu)點(diǎn):可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí),使用濃度