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《生物碩士畢業(yè)答辯4》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、脂聯(lián)素基因去信號肽區(qū)原核表達(dá)及酶免檢測方法研究專業(yè)：微生物學(xué)學(xué)生：孫強導(dǎo)師：王云龍教授主要內(nèi)容研究背景目的及意義實驗技術(shù)路線方法與結(jié)果創(chuàng)新與結(jié)論研究背景脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)性的特異性血漿蛋白。肥胖、冠心病、Ⅱ型糖尿病患者血漿中的脂聯(lián)素低于正常水平。編碼人脂聯(lián)素的apMI基因定位于染色體3q27上，長度為16kbp，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。人脂聯(lián)素由244個氨基酸組成，由分泌信號序列、特異序列、膠原重復(fù)序列、球狀序列等4個結(jié)構(gòu)域組成，其中球狀區(qū)(gADPN)是脂聯(lián)素生物活性的關(guān)鍵部位。脂
2、聯(lián)素(adiponectin)目的及意義可作為冠心病、糖尿病的輔助診斷依據(jù)，并對疾病發(fā)生進行有效的預(yù)警；可作為評價藥物在治療肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面的效果；進一步研究脂聯(lián)素作用機制提供方便；利用基因工程方法制備脂聯(lián)素定量檢測試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，提高了穩(wěn)定性和生物安全性。本研究建立的血漿脂聯(lián)素酶免定量檢測方法——實驗技術(shù)路線方法與結(jié)果（一）人脂聯(lián)素基因去信號肽區(qū)的克隆與鑒定方法與結(jié)果（一）總RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×40μg/mlOD280=0.254，OD260=0.485RNA含量=0.48
3、5×1×40=19.4μg/mL純度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910人脂肪組織總RNA的提取方法與結(jié)果（一）2、PCR擴增目的基因(678bp)M.DNAMarkerDL2000；1.PCRproduct;2.Negativecontrol3、重組質(zhì)粒酶切鑒定M.DNAmarkerDL2000;1.BamHⅠ+XhoⅠdigestionproductsbpM1220001000750500250100bpM120001000750500250100重組ΔSADPN蛋白的誘導(dǎo)表
4、達(dá)及純化方法與結(jié)果（二）方法與結(jié)果（二）1、重組菌BL21(DE3)/pET41a/ΔSADPN誘導(dǎo)表達(dá)(54.5kD)M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Normalcelllysatescontrol;2.celllysatesinducedat25℃for6hours;3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for6hours;4.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for6hours;KDM
5、123497.266.444.329.020.1方法與結(jié)果（二）2、重組ΔSADPN蛋白活性鑒定3、重組ΔSADPN蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化M.ProteinmoleculeweightMarker;1～3.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃4～6.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃30℃37℃KDM12345697.266.444.329.020.1誘導(dǎo)時間的優(yōu)化1～4.Supernatantofc
6、ellllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(4/6/8/10)hours方法與結(jié)果（二）12345678誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化1～4.Supernatantofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/0.03/0.02)mol/LIPTG5～8.Precipitationofcelllysatesinducedat25℃for(0.10/0.05/
7、0.03/0.02)mmol/LIPTG方法與結(jié)果（二）12345678方法與結(jié)果（二）M..ProteinmoleculeweightMarker;1.Sampleofimpurification;2.Elutionproductswith20mmol/LImidazole;3.Elutionproductswith50mmol/LImidazole;4.Elutionproductswith100mmol/LImidazole;5.Elutionproductswith200mmol/LImidaz
8、ole.4、重組ΔSADPN蛋白的純化KDM1234597.266.444.329.020.1方法與結(jié)果（三）雙抗體夾心ELISA檢測方法的初步建立方法與結(jié)果（三）1、檢測標(biāo)準(zhǔn)品的制備2、標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性試驗t=1.112，顯著性概率（Sig.）P=0.309＞0.05，表明在2～8℃和37℃放置144h檢測結(jié)果沒有顯著性差異，制備的標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性較好。方法與結(jié)果（三）3、包被抗體和檢測抗體最佳濃度的選擇方法與結(jié)果（三）4、檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法
