資源描述：
《菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化與活性測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測定14食安（1）班楊澤杰摘要：本文結(jié)合考馬斯亮藍G250染色法，研究了不同純化方法，包括硫酸銨沉淀法、透析法，對菠蘿蛋白酶活性的影響。實驗結(jié)果表明，兩種純化方法都能有效純化菠蘿蛋白酶，但是會對菠蘿蛋白酶的活性造成一定的損失。關(guān)鍵詞：菠蘿蛋白酶沉淀法透析法純化酶活性前言菠蘿蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）簡稱菠蘿酶，是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的一組復合的半胱氨酸巰基蛋白水解酶，它廣泛存在于菠蘿的果實、芽、葉、莖。菠蘿蛋白酶屬于糖蛋白，是由巰基蛋白酶和非蛋白酶組分構(gòu)成的復雜復合物，因含有一個不穩(wěn)定的游離巰基，所以菠蘿蛋白酶極
2、易被氧化而使其酶活下降。菠蘿蛋白酶的相對分子質(zhì)量大約為33000，等電點9.55，最適pH在7.1左右，在偏酸環(huán)境下酶活下降較快，堿性環(huán)境能延緩失活。菠蘿蛋白酶的溫度的最穩(wěn)定范圍是55℃~65℃。金屬鹽離子中NaCl、KCl對酶活的影響不是很大，維生素C、半胱氨酸、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇是菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定劑，EDTA能通過螯合對酶活有影響的金屬離子而保護菠蘿蛋白酶，有機溶劑中甲醇、乙醇、乙二醇對酶活損失較大。在食品工業(yè)中菠蘿蛋白酶作為一種食品添加劑，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺等，可用于肉質(zhì)嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生產(chǎn)等。在醫(yī)藥上它可以治療水腫及多種炎癥，它能幫助迅速
3、結(jié)痂，對正常組織無害，不影響植皮，適用于中小面積深度燒傷的治療。1實驗材料與儀器1.1實驗材料與試劑1.1.1實驗材料新鮮菠蘿（3個），透析袋1.1.2實驗試劑（1）鹽析粗提液0.1mo1/LpH7.8磷酸緩沖液配制（PBS）（配4000mL），0.01mo1/LpH7.8磷酸緩沖液配制（PBS）（配4000mL）（2）酶活力測定試劑1％酪蛋白（進口分裝）（配100mL），激活劑[含20mmo1／L半胱氨酸-鹽酸鹽、1mmo1/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)]，10％三氯乙酸(TCA)1.2實驗儀器和用品1.2.1實驗儀器HJ-6多頭磁力攪拌器：常州國華電器有限公司
4、MC-H18S012多功能紅外爐：廣東美的生活電器制造有限公司DS-1高速組織搗碎機：上海標本模型廠GKC110R2可控硅恒溫水浴鍋：賞花錦屏儀器儀表有限公司TD5M低速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司TDL-60B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠722型可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司UV5100B型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司PL1502-S電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司BS110S分析天平北京賽多利斯天平有限公司BCD-539WT冰箱：青島海爾股份有限公司1.2.2實驗用品（1）以組為單位的用品大試管18mm×200mm（10支）
5、、試管架（2個）、燒杯（50mL×1，100mL×2，200mL×1）、滴管（2支）、玻璃棒（2支）、移液管（5mL×1，1mL×2，0.1mL×1，0.2mL×1）、漏斗（3個）、量筒（100mL×1）、研缽、白瓷板、紗布、濾紙、蒸餾水瓶、洗耳球、標簽紙、橡皮筋。（2）全班共用的用品試劑瓶（1000mL×7，250mL×3，60mL×20）、燒杯（1000mL×4）、塑料燒杯（2000mL×2）、量筒（500mL×2，1000mL×2）、廣泛pH試紙、剪刀、電爐和鍋、蒸餾水容器、透析袋（截留相對分子質(zhì)量8000~14000）。1實驗方法1.1菠蘿蛋白酶的粗酶提取稱取菠蘿皮
6、材料30g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高速攪拌機中，加入約60mL預冷的0.1mo1/LpH7.8PBS，持續(xù)攪拌10~15min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過濾，得到濾液后，用冷凍離心機于4°C3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測定粗提液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性[1]。1.2鹽析根據(jù)附錄的“硫酸銨飽和度計算表”，按30%硫酸銨飽和度計算在上述酶提取液中需添加的固體硫酸銨量，稱取固體硫酸銨于研缽中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后
7、，酶蛋白沉淀析出，4°C4000rpm離心10min，收集沉淀，加入0.1mo1/LpH7.8PBS約15mL至完全溶解，測定其體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性[2]。1.3透析將溶解液裝入2.5cm×8cm透析袋（預先將透析袋在蒸餾水中煮沸30min）中，于500mL燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水3～4次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加2～3滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42-未除凈，若無沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析
