菌種保藏方法

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1、第二章菌種的保藏與復(fù)壯菌種衰退的基本原因是變異，變異是不可避免的，而減緩變異速度則是可能的。變異速度與菌種所處的環(huán)境有密切的關(guān)系，不良環(huán)境條件能促進(jìn)變異，頻繁或過多傳代也是造成衰退變異的重要原因。為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退，這就是菌種保藏與復(fù)壯工作。第二章菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏二、菌種的提純與復(fù)壯一、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對不變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。菌種保藏菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把

2、菌株的優(yōu)良性狀保存下來，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長的條件下保藏。微生物生長要求適宜的溫度、水分、空氣和營養(yǎng)物質(zhì)等，如將菌種處于低溫、干燥、無氧和缺乏營養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時處于休眠狀態(tài)。菌種保藏其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡單易行的方法。在作低溫保藏時，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時胞內(nèi)冰晶較小，

3、對細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。與低溫相關(guān)的保藏方法，如冷凍干燥法、超低溫保藏法等，都是利用低溫條件下細(xì)胞與環(huán)境的特殊平衡原理而設(shè)計的。一、菌種保藏(一)低溫保藏法(二)低溫定期移植法(三)石蠟油低溫保藏法(四)干燥保藏(五)甘油管保藏法(六)真空冷凍干燥法(七)液氮超低溫保存現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:(一)低溫保藏法這是一種常用的簡便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱內(nèi)保藏，這種溫度條件下不能使菌體進(jìn)入休眠，而僅是抑制微生物的生命活動。因此，保藏時間不宜過長

4、，一般不超過1～2個月為宜。本方法雖然簡便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。(二)低溫定期移植法把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般3～6個月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)，定期移植法保藏細(xì)菌，其效果也較好。穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。(二)低溫定期移植法斜面定期移植與穿

5、刺移植法有其缺陷，即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌。因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。(三)石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。(三)石蠟油低溫保藏法具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅

6、菌時滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。(四)干燥保藏微生物生長需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長及處于休眠狀態(tài)，達(dá)到較長期保藏的目的。此法用于細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。為了轉(zhuǎn)接方便，控制接種量以及對菌種的保護(hù)作用，通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進(jìn)行常壓干燥或真空干燥，所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。1.沙土管法取河(海)沙，過0.78mm(24目)篩，用10％鹽酸浸泡24

7、h，倒去鹽酸用清水沖洗至pH呈中性，去水烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過篩，把烘干的沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高約1cm(約2g)，塞棉塞121℃滅菌1h，也可用170℃2h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實證明無菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(≥106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無菌沙土上，每管約0.3～0.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。1.沙土管法也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時管內(nèi)砂土松散，表

8、明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4℃下保存