菌種保藏方法.doc

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1、菌種保藏方法(來源:微生物保藏管理中心)·定期移植法　　亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長充分后，于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時間進(jìn)行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法?！　〔僮鞑襟E如下：1培養(yǎng)基制備1.1器皿準(zhǔn)備　　培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。1.2溶解培養(yǎng)基配料　　先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。1.3調(diào)pH值　　配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)

2、要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調(diào)pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導(dǎo)致測量不準(zhǔn)確和營養(yǎng)成分被破壞。1.4加凝固劑　　配制固體培養(yǎng)基時需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。1.5過濾分裝　　在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。1.6包扎標(biāo)記　　將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。1.7滅

3、菌　　根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。1.8斜面擺放　　滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。1.9無菌檢查　　將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗(yàn)，通常30℃培養(yǎng)1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。2接種2.1斜面接種2.1.1點(diǎn)接　　把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2中央劃線　　從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法　　從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。2.1.4密波狀蜿蜒劃線法　　從斜面

4、底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.1.5挖塊接種法　　挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。2.2穿刺接種　　用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.3液體接種　　挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。3培養(yǎng)　　將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為30～37℃，真菌培養(yǎng)溫度一般為25～28℃。4保藏　　培養(yǎng)好的菌

5、種于4～6℃保存，根據(jù)要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次?！　”２貪穸扔孟鄬穸缺硎荆ǔ?0%～70%。斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對照，防止因意外和污染造成損失。液體石蠟保藏法　　亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法?！　〔僮鞑襟E如下：1液體石蠟的準(zhǔn)備　　選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌：　　121℃

6、濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用?！　?60℃干熱滅菌2個小時，冷卻后，經(jīng)無菌檢查后備用。2斜面培養(yǎng)物的制備　　參照定期移植法。3灌注石蠟　　將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。4保藏4.1　注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（4～6℃）干燥處保藏，保藏時間2～10年。4.2　保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補(bǔ)充無菌的液體石蠟。5恢復(fù)培養(yǎng)　　恢復(fù)培養(yǎng)時，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。沙土管保藏法是載體保藏法的一種。將培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞或孢子用無

7、菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細(xì)胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室溫進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。　　操作步驟如下：1沙土管制備　　將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機(jī)物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡