核酸外切酶、內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶

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1、核酸外切酶（exonuclease）　　核酸外切酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開始按序催化水解3、5-磷酸二酯鍵，降解核苷酸的酶。其水解的最終產(chǎn)物是單個(gè)的核苷酸（DNA為dNTP，RNA為NTP）。按作用的特性差異可以將其分為單鏈的核酸外切酶和雙鏈的核酸外切酶?！　捂湹暮怂嵬馇忻赴ù竽c桿菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）和核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）能夠從5′-末端或3′-末端呈單鏈狀態(tài)的DNA分子上降解DNA，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段，而且是唯一不需要Mg2+離子的活性酶，是一種耐受性很強(qiáng)的核酸酶。核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）可以用來測(cè)定基因組

2、DNA中一些特殊的間隔序列和編碼序列的位置。它只切割末端有單鏈突出的DNA分子。　　雙鏈的核酸外切酶包括大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）、λ噬菌體核酸外切酶（λexo）以及T7噬菌體基因6核酸外切酶等。大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）具有多種催化功能，可以降解雙鏈DNA分子中的許多類型的磷酸二酯鍵。其中主要的催化活性是催化雙鏈DNA按3′→5′的方向從3′-OH末端釋放5′-單核苷酸。大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）通過其3′→5′外切酶活性使雙鏈DNA分子產(chǎn)生出單鏈區(qū)，經(jīng)過這種修飾的DNA再配合使用Klenow酶，同時(shí)加進(jìn)帶放射性同位素的核苷酸，便可以

3、制備特異性的放射性探針。　　λ噬菌體核酸外切酶（λexo）最初是從感染了λ噬菌體的大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的。這種酶催化雙鏈DNA分子從5′-P末端進(jìn)行逐步的水解釋放出5′-單核苷酸。但不能降解5′-OH末端。內(nèi)切酶（incisionenzyme）這是一類能從DNA分子中間水解磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase）,它們的切點(diǎn)大多很嚴(yán)格，要求專一的核苷酸順序識(shí)別順序內(nèi)切酶主要分成三大類?！　〉谝活悆?nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性

4、，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等?！　〉诙悆?nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。如果識(shí)別位置在DNA分子中分

5、布是隨機(jī)的，則識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶每隔46（4096）個(gè)核苷酸就有一個(gè)切點(diǎn)。人的單倍體基因組據(jù)估計(jì)為3×199核苷酸，識(shí)別4個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)將有（3×109/2.5×102）約107個(gè)切點(diǎn)，也就是可被這種酶切成107片段，識(shí)別6個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶也將有（3×109/4×103）約106個(gè)切點(diǎn)。第三類內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。粘性末端的意義：（1

6、）連接便利：不同的DNA雙鏈，只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接，這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多；同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接，通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)狀分子。（2）5’末端標(biāo)記：凸出的5’末端可以用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。凸出的3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等）造成人工粘性末端（3）補(bǔ)平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋骸　　?/p>

7、　　5’……GAA

8、TTC……3’　　3’……CTT

9、AAG……5’　　

10、↑　　垂直虛線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀”核苷酸順序都是GAATTC

11、或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。實(shí)線剪頭表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二個(gè)DNA片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，可通過形成氫鍵而“粘合”。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如HaeⅢ的識(shí)別位置是：　　↓　　5’……GG↓CC……3’　　3’……CC↓GG……’　　↑　　在箭頭所指處切割，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段是：　　5’……GGCC……3’　　和　　3’……CCGG……5’　　有時(shí)候兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，差別只在于

12、當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hp