《DNA甲基化酶》PPT課件

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1、第二節(jié)甲基化酶MethylasemethyltransferaseMethylation原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。一、DNA甲基化酶甲基化酶同限制性內(nèi)切酶具有完全相同的識別順序。甲基化酶使識別順序中的某個堿基發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內(nèi)切酶切開。真核生物中目前只發(fā)現(xiàn)5-甲基胞嘧啶（M5C）。M5C占整個胞嘧啶中的2～7%（果蠅和某些昆蟲例外）。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物種或同一物種的不同組織中，M5C出現(xiàn)的頻率也不盡相同。將限制性內(nèi)切酶和甲基化酶同時作用，可使有幾種可能識別順序的限制性

2、內(nèi)切酶只對其中一種識別順序有效。例如限制性內(nèi)切酶AvaⅠ的識別順序是：5’……CPyCGPuG……3’3’……GPuGCPyC……5’Py可以是任何一種嘧啶，pu可以是任何一種嘌呤。因此可以有4種識別順序。如果同時使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，則AvaⅠ的識別順序?qū)⒅皇?’……CCCGAG……3’。如果有一個DNA片段，有AvaⅠ的3個識別順序，當用AvaⅠ處理后可得4個片段?？墒?，如果先用TaqⅠ甲基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA順序中的有些堿基甲基化，然后再用AvaⅠ去切，結(jié)果只有1個識別順序可被AvaⅠ作用，只產(chǎn)生2個DNA片段。二、甲基化酶的種類在

3、真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多數(shù)都有三個位點特異性的DNA甲基化酶1.Dam甲基化酶DNAAdeninemethylaseGATC腺嘌呤N6位置引入甲基識別CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基受影響酶有：不受影響酶有：Acc65IGGTACCKpnIGGTACCAlwNIBanIIApaIGGGCCCBg1IEcoRIIBstNIEaeINarIGGCGCC等等3.EcoKI甲基化酶識別AAC(N)6GTGCTTG(N)6CACGAN6位置但識別位點少(1/8kb)研究較少而dam（1/256bp）dcm(1/512bp

4、)4.SssI甲基化酶來自原核生物SpiroplasmaCG序列中的C在C5位置上甲基化可在未甲基化或半甲基化鏈上起作用許多酶對此甲基化敏感AatIIClaIXhoISalI等不敏感的有BamHIEcoRISphIKpnISssI甲基化的DNA受E.coliMcrA,McrBC,Mrr系統(tǒng)的限制5.其它甲基化酶DNMT11988年克隆出的真核生物的甲基轉(zhuǎn)移酶.具有催化作用的c端和調(diào)節(jié)功能的N端.三、依賴于甲基化的限制系統(tǒng)依賴于甲基化的內(nèi)切酶E.coli中至少有3種依賴于甲基化的限制系統(tǒng)它們識別的序列各不相同，但只識別經(jīng)過甲基化的序列mcrA,mcrBC,mrr?都限

5、制由CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA?Mrr也限制m6A?McrBC切割兩套位點（G/A）mC，這兩套位點之間間隔2kb，最適為55～103bp，需GTP大多數(shù)常用的E.coli受體都含這三個限制系統(tǒng)三個都不限制Dam,EcoKI,EcoRI修飾的位點McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修飾的位點四、甲基化對限制性內(nèi)切酶酶切的影響1.修飾酶切位點M.TaqI甲基化TCGA中的A，①HincIIGTCGAC所以M.TaqI處理GTCAACDNA后，GTTGACGTCGAC將不GTTAAC受HincII切割②BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果B

6、amHI前面為CC或后面為GG，那么M.MspI處理的DNA抵抗BamHI的切割③構(gòu)建DNA文庫時?用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因組DNA?用M.EcoRI甲基化酶處理，?然后加上合成的EcoRI接頭?當再用EcoRI來切割時只有接頭上的位點可被切割2.產(chǎn)生新酶切位點TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA**AGCT*AGCTDpnI3.用于研究細胞DNA中位點特異性甲基化的水平及分布哺乳動物m5CG、植物的m5CG，m5CNG腸道細胞的Gm6ATCCm5/4CGGMspI可切割，HpaII不

7、可切割Gm6ATCSau3AI可切割，MobI不可切割其它4.對基因組作圖的影響在哺乳動物DNACpG序列出現(xiàn)的頻率大約只有預(yù)計的1/5含CpG序列的識別序列極其稀少大多數(shù)CpG都發(fā)生甲基化含CpG的所有識別序列的酶不能切割思考題：某DNA序列中存在酶切位點，以此DNA為模板，在體外合成DNA序列，當用該酶進行酶切時，發(fā)現(xiàn)酶切不動，試分析可能原因？