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1、5組：李東老師：陳思雙酶切及連接目錄原理類型命名法實驗注意事項連接常見問題及對策DNA的限制性酶切實驗原理核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。根據(jù)限制酶的識別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。限制性內(nèi)切酶的類型限制性內(nèi)切酶的類型第一類（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核
2、苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第二類（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應用于基因克隆。限制性內(nèi)切酶的類型第三類（Ⅱ型）限制性內(nèi)切酶：就是通常指的ＤＮＡ限
3、制性內(nèi)切酶.它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉(zhuǎn)重復順序；Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應用，才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發(fā)展。限制性內(nèi)切酶的類型粘性末端：是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為
4、粘性末端。如EcoRI的識別順序為：5’……G
5、AATTC……3’3’……CTTAA
6、G……5’在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV的識別位置是：5’……GAT
7、ATC……3’3’……CTA
8、TAG……5’切割后形成5’……GATATC……3’3’……CTATAG……5’這種末端同
9、樣可以通過DNA連接酶連接起來。平頭末端：用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E.coli用Eco表示，所以用斜體字。用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。限制性核酸內(nèi)切酶的命名法實驗材料及儀器高速離心機，電爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍，冰盒，槍頭，Ep管，手套，記號筆，TAE
10、電泳緩沖液(10×)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)，質(zhì)粒DNA雙酶切無菌水0.8μL10x緩沖液2μL質(zhì)粒16μLBglI0.6μLSalII0.6μL共20μL按如下體系加入到0.5ml離心管中加體系離心37℃水浴1h跑電泳結(jié)果結(jié)果與分析質(zhì)粒的雙酶切沒有出現(xiàn)結(jié)果但marker出了條帶說明膠沒有問題，而PCR的酶切產(chǎn)物出現(xiàn)了較好的實驗結(jié)果。１．內(nèi)切酶：不應混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量：根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定。同時內(nèi)切酶體積不能超過反
11、應體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會抑制內(nèi)切酶活力；內(nèi)切酶操作應在低溫下進行（冰上）；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。五、注意事項——限制性內(nèi)切酶酶切連接反應DNA分子的體外連接（重組）是指外源DNA片段和載體DNA分子在體外通過DNA連接酶共價連接。DNA酶切片段的聯(lián)接是兩DNA片段相鄰的5'磷酸和3'羥基間可由聯(lián)接酶催化形成磷酸二酯鍵，即能完成聯(lián)接反應。連接體系10×Buffer2.5μL載體1μLDNA10μLT4酶1μL無菌水10.5μL共25μL內(nèi)切酶失活DNA不純，含有
12、SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子條件不適（試劑、溫度）DNA酶切位點上的堿基被甲基化DNA酶切位點上沒有甲基化（如DpnI）DNA位點上存在其它修飾DNA不存在該酶識別順序標準底物檢測酶活性將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA檢查反應系統(tǒng)是否最佳換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+dam+
