熒光分光光度計使用

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1、工作原理熒光產(chǎn)生的原理熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的光。熒光產(chǎn)生的原理：化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量(如光能、化學(xué)能等)而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射(即發(fā)光)。熒光化合物的兩種特征光譜1.熒光激發(fā)光譜，就是通過測量熒光體的發(fā)光通量隨波長變化而獲得的光譜，它反映了不同波長激發(fā)光引起熒光的相對效率。2.熒光發(fā)射光譜，如使激發(fā)光的波長和強(qiáng)度保持不變，而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過發(fā)射單色器后照射于檢測器上，掃描發(fā)射單色器并檢測各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，然后通過記錄儀

2、記錄熒光強(qiáng)度對發(fā)射波長的關(guān)系曲線，所得到的譜圖稱為熒光光譜。物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質(zhì)的定性分析。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其發(fā)射光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會有“自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強(qiáng)度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強(qiáng)度與濃度不成正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行。熒光發(fā)射的特點(diǎn)：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光;而一旦停止供能，發(fā)光(熒光)現(xiàn)象也隨

3、之在瞬間內(nèi)消失。溶液熒光光譜通常具有的特征：(1)斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光的波長總是大于激發(fā)光的波長。(2)熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。(3)熒光發(fā)射光譜的形成與吸收光譜的形狀有鏡像關(guān)系熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成

4、熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜)，即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強(qiáng)度也最大。測量原理稀溶液IF=2.303φFI0εcb,其中，I0為激發(fā)光強(qiáng)度;If為熒光強(qiáng)

5、度;φf為熒光效率;b為液池厚度;ε和c分別為發(fā)光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和摩爾濃度。技術(shù)指標(biāo)：波長掃描范圍：220-900nm波長精度：±1.5nm;狹縫范圍：0.15-20nm信噪比：S/N比150以上(水拉曼峰測定，狹縫5nm)最高掃描速度：5，500nm/min操作規(guī)程1.開機(jī)a.確認(rèn)所測試樣液體或固體，選擇相應(yīng)的附件。b.先開啟儀器主機(jī)電源，預(yù)熱半小時后啟動電腦程序RF-530XPC，儀器自檢通過后，即可正常使用。2.測樣(1)spectrum模式a.在“AcquireMode”中選擇“Spectrum”模式?！τ谧鰺晒夤庾V的樣品，“Con

6、figure”中“Parameters”的參數(shù)設(shè)置如下：“SpectrumType”中選擇Emission;給定EX波長;給定EM的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm);設(shè)定掃描速度;掃描間隔;狹縫寬度，點(diǎn)擊“OK”完成參數(shù)的設(shè)定?！τ谧黾ぐl(fā)光譜的樣品，“Configure”中“Parameters”的參數(shù)設(shè)置如下：“SpectrumType”中選擇Excitation;給定EM波長;給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm);設(shè)定掃描速度;掃描間隔;狹縫寬度，點(diǎn)擊“OK”，完成參數(shù)的設(shè)定。b.在樣品池中放入待測的溶液，點(diǎn)擊“S

7、tart”，即可開始掃描。c.掃描結(jié)束后，系統(tǒng)提示保存文件。可在“Presentation”中選擇“Graf”“Radar”“BothAxesCtrl+R”來調(diào)整顯示結(jié)果范圍;在“Manipulate”中選擇“PeakPick”來標(biāo)出峰位，最后在“Channel”中進(jìn)行通道設(shè)定。d.述操作步驟對固體樣品同樣適用。(2)Quantitative模式a.在“AcquireMode”中選擇“Quantitative”模式。b.“Configure”中“Parameters”的參數(shù)設(shè)置如下：Method選擇“MultiPointWorkingCurve”

8、;“OrderofCurve”中選擇“1st和“No”;給定EX、EM波長;設(shè)定狹縫寬度，點(diǎn)擊“OK”，完成參數(shù)的設(shè)定。c.在樣品池中放