細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶菌種分離與分子鑒定

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1、細(xì)菌產(chǎn)淀粉菌種分離與分子鑒定摘要：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，具有重要的經(jīng)濟(jì)利用價值。本實驗意在篩選產(chǎn)淀粉酶菌種，并進(jìn)行16SrDNA的分子鑒定。通過分離純化rRNA進(jìn)行測序，最終在數(shù)據(jù)庫中查找確定所屬類別。關(guān)鍵字：枯草芽孢桿菌；rRNA；PCR法；序列測定1引言土壤中含有各種微生物，其中包含淀粉酶的枯草芽孢桿菌。在淀粉作為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基中，只有能產(chǎn)生淀粉酶利用淀粉的菌體才能成為優(yōu)勢菌種。在含淀粉作為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基上的平板上，具有產(chǎn)淀粉酶能力的枯草芽孢桿菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周圍出現(xiàn)水

2、解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈藍(lán)色，若菌落周圍能形成淀粉水解圈，表明該菌具有產(chǎn)淀粉酶的能力。對于淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選分析，強調(diào)注意微生物的安全性，防止篩選到一些對人體有害的病原微生物。細(xì)菌中的核糖體RNA分為5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,其中16SrRNA相對分子質(zhì)量適中。16SrDNA由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，不同細(xì)菌的恒定區(qū)序列基本保守，而可變區(qū)序列因細(xì)菌而異，故可利用恒定區(qū)的序列設(shè)計引物將16SrDNA擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異對不同的細(xì)菌進(jìn)行分類。本文旨在篩選自然界中存在的淀粉酶產(chǎn)生菌，并對其1

3、6SrDNA進(jìn)行序列分析得出菌的種屬。2材料和方法2.1儀器與材料2.1.1材料淀粉廠周圍土壤2.1.2培養(yǎng)基實驗過程中所采用的培養(yǎng)基，自行配置。配置過程如下：1）產(chǎn)淀粉酶菌分離培養(yǎng)基——第5頁共5頁可溶性淀粉2%；蛋白胨1%；酵母膏0.5%；碳酸氫二鈉0.5%；氯化鈉0.01%；MgSO4·7H2O0.01%；瓊脂粉2%。配置好后維持PH為7.0-7.4,121℃高壓滅菌20min。2）菌體培養(yǎng)培養(yǎng)基——可溶性淀粉2%；蛋白胨2%；酵母膏0.5%；氯化鈉0.01%；MgSO4·7H2O0.01%。配置好后維持PH為7.0-7.4,

4、121℃高壓滅菌20min。2.1.3儀器高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、pH儀、恒溫水浴鍋、電子天平、錐形瓶、試管、平板、涂布器、玻璃珠、搖床、革蘭氏陽性細(xì)菌DHA提取試劑盒、細(xì)菌16SrRNAPCR鑒定試劑盒、PCR純化試劑盒、移液槍。2.2方法2.2.1細(xì)菌淀粉酶菌種的分離按照產(chǎn)淀粉酶菌分離培養(yǎng)基配方制備200ml培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌30min，無菌室倒平板。稱取0.1g土壤，加入裝有10ml蒸餾水的三角瓶中（已滅菌），震蕩三角瓶分散菌體，后置于80℃水浴約15min。吸取0.5ml菌液加入到4.5ml蒸餾水當(dāng)中混勻，得到10-1

5、濃度的菌液，以此類推制備10-2、10-3濃度梯度菌液。分別吸取梯度濃度菌液100微升，均勻涂布在產(chǎn)淀粉霉菌分離平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，最后取出培養(yǎng)好的平皿，在長出的菌落上滴加碘液，菌落周圍若有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，即菌株能產(chǎn)生淀粉酶。將產(chǎn)透明圈的菌接種后，搖甁培養(yǎng)進(jìn)行分子鑒定。將產(chǎn)透明圈的菌點接種到另一淀粉平板，培養(yǎng)后第二天檢測透明圈和照相。2.2.2細(xì)菌的16SrDNA分子鑒定2.2.2.1革蘭氏陽性菌基因組DNA的提取挑取分離的產(chǎn)淀粉酶單菌落接種到10ml發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜培養(yǎng)，然后按照革蘭氏陽性菌D

6、HA提取試劑盒指導(dǎo)提取細(xì)菌基因組DHA。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)細(xì)菌的基因組DNA，控制電壓在60-80V，電泳時間在45-60min，Marker為100bpLadderDNAMarker,由11種長度在100bp至2000bp的DNA片段組成。第5頁共5頁2.2.2.2PCR擴增細(xì)菌16SrDNA基因片段并純化按照TaKaRa寶生物工程大連有限公司細(xì)菌16SrDNA菌種鑒定試劑盒說明書進(jìn)行，對16SrDNA基因片段進(jìn)行PCR擴增。使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳檢測，確認(rèn)PCR擴增細(xì)菌保守基因16SrDNA基因片段。最后按照

7、Omega公司提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，并將純化產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。根據(jù)所測序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性對比，所測序序列與數(shù)據(jù)庫中已有的菌種16SrDNAPCR的相似度達(dá)99%以上，判斷分離菌種屬并確定微生物在進(jìn)化中的位置。3結(jié)果與討論3.1細(xì)菌淀粉酶菌種的分離分析圖3-1產(chǎn)淀粉酶菌種分離圖3.2細(xì)菌的16SrDNA分子鑒定分析1）第5頁共5頁圖3-2DNA提取后檢測電泳圖譜2）圖3-3PCR擴增細(xì)菌16SrDNA基因片段電泳圖譜3）圖3-4PCR純化結(jié)果電泳圖譜4）16SrDNA可變區(qū)序列的測定

8、結(jié)果：第5頁共5頁GGGCCATGCTAGCAGCTATAGTGTGAGTCTGAGCGCGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGA