熒光定量PCR產(chǎn)品研發(fā)規(guī)程

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1、熒光定量PCR產(chǎn)品研發(fā)規(guī)程1．研發(fā)產(chǎn)品立項依據(jù)（項目可行性報告）：(1)需要檢測的病原體是病毒還是細菌、真菌等其它病原體，致病菌是一種病原體或者是幾種病原體。如果是針對病毒的檢測，需要了解病毒的亞型和基因分型的標準。如果是針對基因的檢測，需要檢測的基因有哪些。(2)病原體的分類位置情況，病原體的感染和致病機制，病原體的生活史。(3)現(xiàn)有病原體檢測的方法，各自的優(yōu)劣，什么方法是目前認可的金標準，熒光定量PCR的優(yōu)勢。(4)病原體檢測或診斷的臨床意義，什么類型的樣品最適合的樣品，有多少適合檢測的樣品類型。(5)國內(nèi)外同類產(chǎn)品情況：什么公司有同類的產(chǎn)品，

2、有多少公司有該產(chǎn)品，占市場主導地位的是哪家公司的產(chǎn)品？技術原理和技術優(yōu)勢、質(zhì)量標準和適用的檢測樣品類型，包裝規(guī)格和說明書信息，其產(chǎn)品的市場反應情況，是否有有批文的產(chǎn)品。(6)市場需求情況（可由公司市場銷售人員進行調(diào)研）(7)臨床標本獲得情況（是否可以得到陽性標本，從哪里得到臨床樣品，陽性樣品量是否足夠）(8)SFDA報批的可能性（從生檢所了解）(9)參比品（從生檢所了解）：參比品主要是特異性參比品、敏感性參比品和最低檢出量標準品。是否有國家標準品。(10)技術方法的文獻資料：l主要是有無特異性的引物和探針序列，基因組片段，基因組序列。確定引物和探針

3、序列以及在基因組上的具體位置。lQ-PCR（RT-QPCR，復合Q-PCR）擴增體系，擴增片斷大小，探針類型和熒光標記類型。l檢測靈敏性，進行靈敏度檢測的質(zhì)控品及其制備，最低檢出率。l檢測特異性，特異性檢測的參考品極其參考品的范圍。l可以檢測的臨床樣品類型l針對不同種類臨床樣品的處理方法。2．產(chǎn)品研制技術路線(1)基因組序列和序列比較：查找病原體的基因組序列，對于病毒檢測，需要分析比對病毒亞型的基因組序列。對于基因檢測，需要查找相關基因組序列。（2）擴增引物與探針的選擇：根據(jù)文獻資料和基因組序列，核實引物序列和探針序列，或者根據(jù)現(xiàn)有基因組序列，設計

4、至少三種引物和探針組合，選擇熒光染料和淬滅分子類型。(2)合成引物和探針需要了解不同引物廠家的引物合成質(zhì)量，包括價格，國內(nèi)從事DNA合成的廠家很多，一般的PCR擴增引物都可以滿足實驗要求，但更應該關注熒光標記探針的質(zhì)量。(3)陽性質(zhì)控品的制備利用陽性標本的PCR擴增產(chǎn)物來制備強陽性質(zhì)控品（1x106拷貝/ul）和臨界陽性質(zhì)控品（1x102拷貝/ul）。(4)利用實驗用水作陰性質(zhì)控品(5)陽性標本和陰性標本的選擇：確認陰、陽性樣品的金標準。(6)主要原材料的選擇、制備：TaqDNApolymerase制備或選擇,引物合成，探針的標記制備。(7)建立熒

5、光定量PCR擴增系統(tǒng)：確定擴增反應的體積，4xdNTP終濃度，引物濃度，探針濃度，MgCl2濃度，TaqDNApolymerase用量。(8)引物探針組合的選擇和參數(shù)優(yōu)化：利用低拷貝陽性質(zhì)控品來驗證引物特別是探針的質(zhì)量和效果。調(diào)整PCR擴增參數(shù)，包括擴增系統(tǒng)的檢測靈敏度，需要驗證熒光信號的強度，熒光信號的曲線狀態(tài)。根據(jù)實驗結(jié)果選擇一個最好的引物探針組合。(9)最低檢出量的測定利用系列稀釋的陽性定量標準品來確定熒光PCR的最低檢出量。最好用國家標準或者接近病原體的陽性自制定量標準品來確定最低檢出量。必要時可以利用利用現(xiàn)有的一些手段來調(diào)節(jié)PCR系統(tǒng)以便

6、提高PCR檢測的靈敏度。(10)陽性、陰性參考品的選擇與研制：利用金標準（國家標準品、或用有批文的同類產(chǎn)品或者其它被認可的檢測手段）來選擇陽性參考品和陰性參考品，測定熒光定量PCR試劑盒的檢測特異性。(11)檢測特異性測定：利用選擇的陰性參考品（陰性標本）來檢測特異性。無該病受檢者檢出的陰性例數(shù)檢測特異性（100%）=x100%無該病受檢者的總例數(shù)(12)檢測敏感性測定：利用選擇的陽性參考品（陽性標本）來檢測敏感性。已知患該病檢出的陽性例數(shù)檢測靈敏度（100%）=x100%已知患該病檢出的總例數(shù)(2)樣品處理方法的選擇和建立利用陽性臨床樣品來驗證樣

7、品處理方法的簡便性、穩(wěn)定性和核酸提取的質(zhì)量（純度和得率）。(3)測定精密性：針對同一陽性質(zhì)控品和陽性樣品連續(xù)檢測十次，CV值<15%(4)試劑盒穩(wěn)定性試驗，即把試劑盒放在37℃破壞3天后，與未破壞的試劑盒同時檢測，測試試劑盒穩(wěn)定性。3．參考值（參考范圍）確定4．制定產(chǎn)品質(zhì)量標準和質(zhì)量檢測的SOP5．生產(chǎn)SOP編寫4.按SOP生產(chǎn)工藝生產(chǎn)三批，編制生產(chǎn)紀錄。5.自我質(zhì)量檢驗，編制質(zhì)量檢驗紀錄6．產(chǎn)品性能評估等相關工作l分析性能：包括分析靈敏度、分析特異性、測定范圍、測定準確性、批內(nèi)不精密度、批間不精密度等。l臨床性能：臨床性能主要包括臨床靈敏度、臨床

8、特異性等。臨床性能評估應通過臨床試驗，臨床研究總樣本數(shù)至少為500例。一般上要做1000例。臨床試驗由申請人在提出注冊申請