《生化反應(yīng)工程實(shí)驗(yàn)》PPT課件

《《生化反應(yīng)工程實(shí)驗(yàn)》PPT課件》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、枯草桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)與堿性磷酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究方法；2.鞏固還原糖和生物量的測(cè)定原理與方法；3.掌握酶反應(yīng)速度的實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法；4.掌握最大反應(yīng)速度rmax和米氏常數(shù)Km的測(cè)定方法。二．實(shí)驗(yàn)原理對(duì)細(xì)胞反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)可得不同t的底物濃度Cs值和Cx值(細(xì)胞濃度)。要求動(dòng)力學(xué)參數(shù)KS，μmax；必求μ，——測(cè)定時(shí)間區(qū)間△t內(nèi)細(xì)胞濃度平均值。堿性磷酸酶堿性條件下，催化磷酸單酯水解。根據(jù)酶催化反應(yīng)機(jī)理：可推導(dǎo)出米氏方程：通過(guò)測(cè)定不同底物濃度CS下的反應(yīng)速度r，可確定rmax和Km。在510nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定OD值，從而計(jì)算出酶的活性（反應(yīng)速度r）。ONa│O－P==O│

2、│ONaOH│+Na2HPO4+H2O堿性磷酸酶一定pH、T催化反應(yīng)：醌類化合物（紅色）OH│+AAP鐵氰化鉀OH－三．菌種、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器1．枯草芽孢桿菌AS1.3982．Tris-培養(yǎng)基：葡萄糖0.4%；NaCl0.5%；（NH4）2SO41%；KCl0.1%；CaCl20.1mmol/L；MgCl21mmol/L；Na2HPO420μmol/L；酪蛋白水解物0.1%，溶于0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.4）中。分裝于150ml三角瓶中，每瓶裝50ml，于115℃，滅菌30min，冷卻。（周二下午做)3．0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.4）4．0

3、.1mol/LpH8.8Tris-醋酸緩沖液5．40mmol/L底物溶液6．0.5mol/L氫氧化鈉溶液7．0.3%（W/V）4-氨基安替比林（AAP）溶液8．0.5%（W/V）鐵氰化鉀溶液9．3,5－二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)10．1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液11.甲苯12．移液管，刻度試管，容量瓶，濾紙，三角瓶，布式漏斗，電子天平，恒溫水浴槽，搖床，干燥箱，721分光光度計(jì)，滅菌鍋，冰箱。四．實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.種子液制備（以班為單位）枯草桿菌在固體斜面培養(yǎng)基上活化后。接入8個(gè)裝有50mlTris-培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，于30℃振蕩培養(yǎng)18h作為種子液。（周三下午2:30做)2.發(fā)酵液

4、制備（以組為單位）將上述培養(yǎng)好的種子液接入10個(gè)裝有50mlTris-培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，接種量5％（v：v），于37℃振蕩培養(yǎng)0h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h(發(fā)酵到上述每一定時(shí)間取一瓶，測(cè)定發(fā)酵液的殘?zhí)呛亢蜕锪浚瑴y(cè)定原理與方法見(jiàn)附錄一，二)。培養(yǎng)時(shí)間（hr）0122.533.544.555.5生物量mg/ml殘?zhí)莔g/ml表1發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)3．枯草桿菌堿性磷酸酶酶液的制備取種子液2瓶，分別加入甲苯（甲苯與種子液體積比1：20）（加一滴甲苯/1ml培養(yǎng)液），搖勻，37℃保溫30min，制成酶液備用。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究試劑（ml）10

5、2030405060空白底物溶液0.10.20.30.40.81.0—pH8.8Tris緩沖液1.01.01.01.01.01.01.0蒸餾水0.90.80.70.60.2—1.0NaOH溶液1.01.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.01.0鐵氰化鉀溶液2.02.02.02.02.02.02.0充分混勻，放置10minA510nm反應(yīng)前：反應(yīng)后：試劑（ml）123456底物溶液0.10.20.30.40.81.0pH8.8Tris緩沖液0.60.60.60.60.60.6蒸餾水0.90.80.70.60.2—37℃水浴保溫5min酶液0.40

6、.40.40.40.40.4充分搖勻，37℃準(zhǔn)確保溫15minNaOH溶液1.01.01.01.01.01.00.3%AAP溶液1.01.01.01.01.01.0鐵氰化鉀溶液2.02.02.02.02.02.0充分混勻，放置10minA510nm酶活力（單位）=△OD510×1000=（OD510反應(yīng)后－OD510反應(yīng)前）×1000r即為酶活力。底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響——rmax和Km的測(cè)定取13支試管，編號(hào)，按下表準(zhǔn)確操作。以空白管調(diào)零點(diǎn)，在510nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定A510nm。五．實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.發(fā)酵動(dòng)力學(xué)確定發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理做確定μmax與Ks。進(jìn)而確定發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。4.5～5.085.

7、0～5.594.0～4.573.5～4.063.0～3.552.5～3.042.0～2.531.0～2.020.0～1.01△t序號(hào)△2.底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響——rmax和Km的測(cè)定CSr1/CS1/r酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理在坐標(biāo)紙上做1/r～1/CS圖，由此求Km和rmax值。3,5－二硝基水楊酸比色法(DNS法)測(cè)定還原糖附錄一△一．原理在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)