《疫熒光技術(shù)》PPT課件

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1、免疫熒光技術(shù)威斯騰生物技術(shù)中心威斯騰生物成立12周年慶主要內(nèi)容技術(shù)原理1實(shí)驗(yàn)流程2注意事項(xiàng)3常見(jiàn)問(wèn)題4免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence)技術(shù)原理將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類：直接法間接法補(bǔ)體法其他補(bǔ)體法：利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過(guò)形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光。其他免疫熒光技術(shù)：時(shí)間分辨免疫熒光分

2、析熒光偏振免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強(qiáng)

3、弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測(cè)小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測(cè)定。激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以

4、用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量,配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。熒光顯微鏡的不足之處：1、無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光、透射光的同時(shí)采集，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集和共定位。2、熒光的散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3、熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4、無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描，完成3D的工作。5、濾鏡對(duì)熒光信號(hào)衰減大，靈敏度和熒光強(qiáng)度不夠。6、可以觀察活細(xì)胞和組織，但是細(xì)胞或組織內(nèi)機(jī)構(gòu)高度重疊。7、只能在二維壞境下觀察。8、樣品不能太厚。9、放大倍率小。熒光常見(jiàn)基礎(chǔ)術(shù)語(yǔ)：熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射

5、光長(zhǎng)的光線，即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素。激發(fā)光：能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI，DAPI）、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）。自發(fā)熒光：組織和細(xì)胞中某些成分受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光，即自發(fā)熒光。漂白：熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失，即漂白現(xiàn)象。多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測(cè)）：在可見(jiàn)光范圍內(nèi)使用多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為457nm、488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖綠HeNe（G）激光器提供發(fā)射波長(zhǎng)為543nm的綠光，氦氖紅HeNe（R）

6、激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的紅光，新的405nm的半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線。目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種：異硫氰酸熒光(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490～495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色

7、。四乙基羅丹明(rhodamine,RB200)RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單?dú)標(biāo)記染色。酶作用后產(chǎn)生熒光的