《細(xì)胞的破碎》PPT課件

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1、細(xì)胞破碎技術(shù)第二章細(xì)胞破碎技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎第三節(jié)包涵體第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細(xì)胞壁是微生物菌體比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不僅取決于微生物的類型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細(xì)胞所處的生長階段、細(xì)胞的存儲(chǔ)方式以及其它一些因素。不同微生物菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有一定差異。一、細(xì)菌細(xì)菌的細(xì)胞壁堅(jiān)韌而有彈性，由不同的肽鏈結(jié)合組成質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其厚度因細(xì)菌不同而有差異，可抵御外界的機(jī)械損傷，并可承受細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)大的滲透壓而不被破壞。第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細(xì)胞壁的主要成份是肽聚糖，由N—乙酰葡糖

2、胺（見圖2-1a）和N—乙酰胞壁酸（見圖2-1b）構(gòu)成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N—乙酰胞壁酸分子上四肽側(cè)鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過肽橋或肽鍵連接起來，組成機(jī)械性很強(qiáng)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，像膠合板一樣，粘合成多層。各種細(xì)菌細(xì)胞壁酞聚糖結(jié)構(gòu)均相同，但在四肽側(cè)鏈的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁（見圖2-2）較厚，約20～80nm。含15～50層肽聚糖片層，每層厚度1nm，約占細(xì)胞干重的50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成圖2-1細(xì)菌

3、細(xì)胞壁的主要組分第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁（見圖2-3）細(xì)胞壁較薄，有1～2層肽聚糖片，在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類和蛋白質(zhì)等在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)上非常重要，如果被抽提，細(xì)胞壁將變得很不牢固。第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成二、真菌和酵母真菌的細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)（N-乙酰葡萄糖胺的一種聚合物）纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外還有蛋白質(zhì)、類脂、無機(jī)鹽等。而酵母的細(xì)胞壁（見圖2-4）由特殊的纖絲狀物質(zhì)構(gòu)成，主要成份是甘露聚糖（31%），

4、葡聚糖（29%），蛋白質(zhì)（13%）和類脂質(zhì)（8.5%）。酵母中的葡聚糖的為β-1，6-葡聚糖通過β-1，3鍵與D-葡萄糖中第一側(cè)鏈交連而不溶于水。所有的真菌細(xì)胞壁是由不同的多糖鏈相互纏繞成一股又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質(zhì)及類脂和一些小分子的多糖基質(zhì)中，看起來像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和硬度。第一節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成三、藻類藻類的細(xì)胞壁更為復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)成份，是纖絲狀的多糖類物質(zhì)。M-甘露聚糠；P-磷酸二脂鍵；G-葡聚糠圖2-4酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎細(xì)胞破碎的方法很多

5、，在諸多破碎方法中，機(jī)械法中的球磨機(jī)和高壓勻漿機(jī)不僅在實(shí)驗(yàn)室而且在工業(yè)得到應(yīng)用。其它的方法大多尚停留在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，工業(yè)化的應(yīng)用還在探索之中。一、球磨法球磨機(jī)是破碎微生物細(xì)胞的常用設(shè)備，一般有立式（見圖2-5）或臥式（見圖2-6）兩種，在磨腔中裝入小玻璃球或小鋼球，由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)攪拌碟片高速攪拌微生物細(xì)胞懸浮物和小磨球而產(chǎn)生剪切力，將細(xì)胞破碎。第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎圖2-5NetzschMolinexKE5攪拌磨圖2-6NetzshLM20砂磨機(jī)第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎破碎作用遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律：（2-1）式中R—

6、—t時(shí)間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）；Rm——100%破碎細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）。k——破碎的比速率，s-1；t——球磨機(jī)工作的時(shí)間，s。第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎將上式由開始工作到t時(shí)刻積分，可得：（2-2）式中x——為R/Rm，t時(shí)刻釋放蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)，x數(shù)值越大，表示破碎程度越高。一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎式中N0——原始細(xì)胞數(shù)量；N——經(jīng)t時(shí)刻操作后保留下來的未受損害完整細(xì)胞的數(shù)量。N0和N可由直接計(jì)數(shù)法和間接法求得。直接計(jì)

7、數(shù)法是直接對(duì)稀釋后的樣品用血球計(jì)數(shù)器或平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去細(xì)胞碎片，未破碎的細(xì)胞及其他懸浮物，然后對(duì)清液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量或酶的活性進(jìn)行分析。通過細(xì)胞釋放出來的化合物的量R與所有細(xì)胞理論最大釋放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。（2-3）第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎破碎率是選擇細(xì)胞破碎設(shè)備的重要依據(jù)之一。在用球磨法破碎細(xì)胞的過程中，影響因素有以下幾個(gè)方面：（1）攪拌器外緣速率攪拌器速度增加，剪切力增大，細(xì)胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的熱量產(chǎn)生和磨球的磨損以及

8、因剪切力引起產(chǎn)物失活，因此對(duì)于給定處理量和對(duì)蛋白質(zhì)的釋放要求下，存在著最佳效率點(diǎn)。實(shí)際生產(chǎn)中，攪拌器外緣速率控制在（5～15）m/s之間。第二節(jié)細(xì)胞壁的破碎（2）細(xì)胞的濃度在細(xì)胞破碎過程中，產(chǎn)生的熱量隨濃度的增大而提高，增加了冷卻的費(fèi)用。因此最佳的細(xì)胞濃度由實(shí)驗(yàn)來確定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或細(xì)菌時(shí)，細(xì)胞濃度控制在40%左右。（3）球粒大小和裝填量磨球越小，細(xì)胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研磨機(jī)中，球徑