《細胞的破碎》PPT課件.ppt

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1、細胞破碎技術(shù)第二章細胞破碎技術(shù)第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成第二節(jié)細胞壁的破碎第三節(jié)包涵體第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細胞壁是微生物菌體比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不僅取決于微生物的類型，還取決于培養(yǎng)發(fā)酵液的組成、細胞所處的生長階段、細胞的存儲方式以及其它一些因素。不同微生物菌體細胞壁的結(jié)構(gòu)有一定差異。一、細菌細菌的細胞壁堅韌而有彈性，由不同的肽鏈結(jié)合組成質(zhì)量均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其厚度因細菌不同而有差異，可抵御外界的機械損傷，并可承受細胞內(nèi)強大的滲透壓而不被破壞。第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成細胞壁的主要成份是肽聚糖，由N—乙酰葡糖胺（見圖2-1a）和N—乙酰胞壁酸（見圖2-1b

2、）構(gòu)成雙糖單元，以β（1-4）糖苷鍵連接成大分子。N—乙酰胞壁酸分子上四肽側(cè)鏈，相鄰葡聚糖纖維之間的短肽通過肽橋或肽鍵連接起來，組成機械性很強的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，像膠合板一樣，粘合成多層。各種細菌細胞壁酞聚糖結(jié)構(gòu)均相同，但在四肽側(cè)鏈的組成及其連接方式上隨菌種不同而有差異。革蘭氏陽性菌細胞壁（見圖2-2）較厚，約20～80nm。含15～50層肽聚糖片層，每層厚度1nm，約占細胞干重的50%～80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成圖2-1細菌細胞壁的主要組分第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成革蘭氏陰性菌細胞壁（見圖2-3）細胞壁較薄，有1～2層肽

3、聚糖片，在肽聚糖層外尚有脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是將外膜固定于肽聚糖層，脂類和蛋白質(zhì)等在穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)上非常重要，如果被抽提，細胞壁將變得很不牢固。第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成二、真菌和酵母真菌的細胞壁含有幾丁質(zhì)（N-乙酰葡萄糖胺的一種聚合物）纖維素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。此外還有蛋白質(zhì)、類脂、無機鹽等。而酵母的細胞壁（見圖2-4）由特殊的纖絲狀物質(zhì)構(gòu)成，主要成份是甘露聚糖（31%），葡聚糖（29%），蛋白質(zhì)（13%）和類脂質(zhì)（8.5%）。酵母中的葡聚糖的為β-1，6-葡聚糖通過β-1，3鍵與D-葡萄糖中第一側(cè)鏈交連而不溶于水

4、。所有的真菌細胞壁是由不同的多糖鏈相互纏繞成一股又粗又壯的鏈，嵌入在蛋白質(zhì)及類脂和一些小分子的多糖基質(zhì)中，看起來像鋼筋混凝土，從而解釋了真菌細胞壁的機械強度和硬度。第一節(jié)細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成三、藻類藻類的細胞壁更為復(fù)雜，其主要結(jié)構(gòu)成份，是纖絲狀的多糖類物質(zhì)。M-甘露聚糠；P-磷酸二脂鍵；G-葡聚糠圖2-4酵母細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖第二節(jié)細胞壁的破碎細胞破碎的方法很多，在諸多破碎方法中，機械法中的球磨機和高壓勻漿機不僅在實驗室而且在工業(yè)得到應(yīng)用。其它的方法大多尚停留在實驗室應(yīng)用，工業(yè)化的應(yīng)用還在探索之中。一、球磨法球磨機是破碎微生物細胞的常用設(shè)備，一般有立

5、式（見圖2-5）或臥式（見圖2-6）兩種，在磨腔中裝入小玻璃球或小鋼球，由電動機帶動攪拌碟片高速攪拌微生物細胞懸浮物和小磨球而產(chǎn)生剪切力，將細胞破碎。第二節(jié)細胞壁的破碎圖2-5NetzschMolinexKE5攪拌磨圖2-6NetzshLM20砂磨機第二節(jié)細胞壁的破碎破碎作用遵循一級動力學(xué)定律：（2-1）式中R——t時間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）；Rm——100%破碎細胞釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量（mg/g）。k——破碎的比速率，s-1；t——球磨機工作的時間，s。第二節(jié)細胞壁的破碎將上式由開始工作到t時刻積分，可得：（2-2）式中x——為R/Rm，t時

6、刻釋放蛋白質(zhì)的分數(shù)，x數(shù)值越大，表示破碎程度越高。一般用破碎率Y表示破碎程度。破碎率定義為被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞的百分數(shù)。第二節(jié)細胞壁的破碎式中N0——原始細胞數(shù)量；N——經(jīng)t時刻操作后保留下來的未受損害完整細胞的數(shù)量。N0和N可由直接計數(shù)法和間接法求得。直接計數(shù)法是直接對稀釋后的樣品用血球計數(shù)器或平板菌落計數(shù)法進行計數(shù)。間接計數(shù)法是在細胞破碎后，將懸浮液離心分離，除去細胞碎片，未破碎的細胞及其他懸浮物，然后對清液進行蛋白質(zhì)含量或酶的活性進行分析。通過細胞釋放出來的化合物的量R與所有細胞理論最大釋放量Rm的比值R/Rm，求出破碎率。（2-3）第

7、二節(jié)細胞壁的破碎破碎率是選擇細胞破碎設(shè)備的重要依據(jù)之一。在用球磨法破碎細胞的過程中，影響因素有以下幾個方面：（1）攪拌器外緣速率攪拌器速度增加，剪切力增大，細胞破碎量增大，但是高的能量消耗，高的熱量產(chǎn)生和磨球的磨損以及因剪切力引起產(chǎn)物失活，因此對于給定處理量和對蛋白質(zhì)的釋放要求下，存在著最佳效率點。實際生產(chǎn)中，攪拌器外緣速率控制在（5～15）m/s之間。第二節(jié)細胞壁的破碎（2）細胞的濃度在細胞破碎過程中，產(chǎn)生的熱量隨濃度的增大而提高，增加了冷卻的費用。因此最佳的細胞濃度由實驗來確定。用NetzshLM20研磨和破碎酵母或細菌時，細胞濃度控制在40%

8、左右。（3）球粒大小和裝填量磨球越小，細胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，難以停留在磨腔中。因此實驗室規(guī)模的研磨機中，球徑