多種細(xì)胞體系Gq蛋白偶聯(lián)受體和IP3受體偶聯(lián)的分析

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1、中文摘要感神經(jīng)節(jié)被首次發(fā)現(xiàn)，它是一種慢激活，非失活的電壓依賴性外向鉀離子電流，因其可被毒蕈堿受體強(qiáng)烈抑制而得名。自1998年以來(lái)人們逐漸認(rèn)識(shí)到其分子基礎(chǔ)是KCNQ家族(KCNQ2／3)的鉀離子通道。M電流與神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性密切相關(guān)。自電流被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在20多年的時(shí)間里，人們對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制做了大量深入的研究，耳前己發(fā)現(xiàn)許多于G0蛋白偶聯(lián)的受體激活后均能引起M電流的抑制，并且膜磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)參與了膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。己證實(shí)G。蛋白偶聯(lián)受體激活后，都會(huì)引起位于胞膜內(nèi)側(cè)的PIP2水解，產(chǎn)生IP，和DAG。已有的研究結(jié)果證實(shí)M1受體的激活引起M

2、電流的抑制是由于PIP：的水解所為，而另外一種受體BK2受體激活后雖然也產(chǎn)生I^和DAG，但它激活后所引起的M電流抑制是通過鈣離子介導(dǎo)，由鈣調(diào)素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。同樣是利用PLC信號(hào)通路的M】受體和BK2受體為何會(huì)分別利用PIP2和鈣離子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)M電流的調(diào)控?因此，目前對(duì)于這一問題有人提出了用微域結(jié)構(gòu)來(lái)解釋這種信號(hào)傳導(dǎo)的特異性，他們認(rèn)為BK2受體與IP3受體處于同一個(gè)微域結(jié)構(gòu)內(nèi)，因此BK2受體激活后所產(chǎn)生的IP，能以較大濃度作用于附近的IP3受體，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放；而M受體和IP3受體卻沒有形成相應(yīng)的微域結(jié)構(gòu)，因此其激活后所產(chǎn)生的IP3在局部不能形成使

3、IP3受體激活的有效濃度，從而不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論是建立在以大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)為研究的基礎(chǔ)上而得出的。眾所周知，磷脂酶C信號(hào)通路是一種廣泛存在于眾多生命形式中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。因此，這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異性在其他的神經(jīng)細(xì)胞是否存在還不得而知。這一問題的闡明，將對(duì)深入了解磷脂酶C信號(hào)通路的多樣性具有中文摘要至關(guān)重要的意義。·本小組前期的研究結(jié)果表明：在不同的神經(jīng)細(xì)胞中，M，，BK2，Hl，ATl受體激活后雖然都可以水解PIP2，產(chǎn)生IP3和DAG，但是引發(fā)內(nèi)鈣釋放的作用之間存在明顯不同，在頸上神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)BK2，H1，AT，受體激活后均可以

4、引起內(nèi)鈣的升高，而M，受體則不能。在海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，BK2，H1，M，受體激動(dòng)后引起內(nèi)鈣升高，而ATl受體則不能。在HEK293細(xì)胞內(nèi)，過表達(dá)M。和BK2受體引起的內(nèi)鈣釋放與神經(jīng)細(xì)胞又有所不同，二者均可以引起內(nèi)鈣升高。在爪蟾卵母細(xì)胞過表達(dá)M。和BK2受體也均可以引起內(nèi)鈣的升高。本實(shí)驗(yàn)以大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、海馬神經(jīng)元、HEK293細(xì)胞、爪蟾卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，利用免疫共沉淀技術(shù)觀察不同Ga蛋白偶聯(lián)受體和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IP3受體之間的關(guān)系，探究是否存在一種信號(hào)微域以及其特點(diǎn)，從而為G。蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)通路的多樣性尋找生化依據(jù)。目的：利用免疫共沉淀

5、技術(shù)，在兩種不同類型的神經(jīng)細(xì)胞、HEK293細(xì)胞以及爪蟾卵母細(xì)胞，觀察不同Ga蛋白偶聯(lián)受體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)11'3受體之間的關(guān)系。方法：采用免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)，SDS．PAGE，Westernblot等方法觀察在頸上交感神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中上述四種G。蛋白偶聯(lián)受體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體之間的關(guān)系。在HE懟93細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法外源性表達(dá)M1、H1、ATl、BK2受體，觀察這四種受體與IP3受體的關(guān)系。在爪蟾卵母細(xì)胞中，利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA在卵母細(xì)胞外源性表達(dá)M，和BK2受體，觀察這兩種受體與IP3受體之間的關(guān)系。

6、中文摘要結(jié)果：(1)在頸上神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中，均可檢測(cè)到M1、H1、ATl、BK2受體的表達(dá)。(2)在頸上神經(jīng)節(jié)和海馬神經(jīng)元中，均可檢測(cè)到IB受體的表達(dá)。(3)免疫共沉淀的結(jié)果表明，在頸上交感神經(jīng)節(jié)中，H。、AT，、BK2受體均可以和IP，受體共沉淀，未發(fā)現(xiàn)M，和IP3受體共沉淀。在海馬神經(jīng)元，AT，受體可以和IP3受體共沉淀，未發(fā)現(xiàn)M，、H】、BK2受體和IP3受體共沉淀。(4)在分別外源性表達(dá)M1、H1、ATl、BKz受體的HEK293細(xì)胞中，均可以分別檢測(cè)到四種受體的表達(dá)。(5)在外源性表達(dá)這四種受體的HEK293細(xì)胞中，均可以檢測(cè)到IP3

7、受體的表達(dá)。(6)在過表達(dá)這四種受體的細(xì)胞中，M1、BKz、ATl與IP3受體共沉淀，而H1受體不能與IP3受體共沉淀。(7)在過表達(dá)M】和BK2受體的爪蟾卵母細(xì)胞中，均可以檢測(cè)到這兩種受體的過表達(dá)。(8)在過表達(dá)M，和BK2受體的爪蟾卵母細(xì)胞中，均可以檢測(cè)到IP3受體的表達(dá)。(93在爪蟾卵母細(xì)胞中，這兩種受體均可以和IR受體共沉淀。結(jié)論：(1)在大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中中，M，受體和Hl、ATl、BK2受體與IP3受體之間的關(guān)系不同，其中，H1、ATl、BK2受體與IP3受體相偶連，而M1和IP3受體之間不存在偶連關(guān)系。在海馬神經(jīng)元中，AT。和I

8、P3受體相偶連，M1、BK2、H1受體和IP3受體之間不存在偶連關(guān)系。(2)在HEK293細(xì)胞中，M1、H1、ATl、BK