乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究

《乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。

1、——實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究大綱一、研究背景；二、研究?jī)?nèi)容；三、實(shí)驗(yàn)材料及方法；四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；四、后續(xù)工作展望。一、研究背景乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及其抑制劑乙酰膽堿酯酶在人體中主要存在于神經(jīng)肌肉組織的突觸后膜上,已知其主要功能是催化乙酰膽堿的分解,在膽堿能神經(jīng)纖維的信號(hào)傳導(dǎo)中扮演重要角色。乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿的分解，直接造成神經(jīng)信號(hào)傳遞失敗,引起老年癡呆癥。AChE抑制劑AChE抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使得乙酰膽堿正常釋放，神經(jīng)沖動(dòng)正常進(jìn)行，

2、可起到治療老年癡呆癥的作用。二、研究?jī)?nèi)容1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停毫虼阴Ｄ憠A(ATch)在乙酰膽堿酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代膽堿,硫代膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)迅速作用,生成在412nm處有光吸收的黃色物質(zhì),在酶催化反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)階段其OD值即可代表起始反應(yīng)速率。2.AChE抑制劑對(duì)AChEIC50值的測(cè)定(IC50:即抑制率為50%時(shí)的抑制劑濃度).3.樣品中AChE抑制劑對(duì)AChE的抑制類(lèi)型研究。三、實(shí)驗(yàn)材料及方法實(shí)驗(yàn)主要儀器、試劑1.儀器：分光光度計(jì)2.主要試劑：乙酰膽堿酯酶(AChE);50mmol/L、pH

3、8.0的PBS;15mmol/L二硫二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(用50mmol/L,pH8.0PBS配制),15mmol/L硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine,ATch,用50mmol/L,pH8.0PBS配制),4%十二烷基硫酸鈉(SDS)等。三、實(shí)驗(yàn)材料及方法試驗(yàn)方法樣品提純及處理試驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)牡孜餄舛攘虼阴Ｄ憠A標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。AChE抑制劑對(duì)AChEIC50值的測(cè)定抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型的確定三、實(shí)驗(yàn)材料及方法1.樣品提純及處理。提取樣品后，烘干后，用PBS緩沖液定容到終濃度10mg/L。2.通過(guò)

4、實(shí)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)孜餄舛确秶?。反?yīng)體系中的酶量為120μL15mM/3mL。通過(guò)一系列的底物濃度，確定最適濃度范圍。三、實(shí)驗(yàn)材料及方法3.硫代乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取20，40，60，80，100，120μL15mM硫代乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)液，加入等量顯色劑二硫二硝基苯甲酸（DTNB)，以PBS緩沖液定量至3mL測(cè)定412nm處吸光值。橫軸為5mL測(cè)試液中硫代乙酰膽堿微摩爾數(shù)，縱軸為吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（用于后面的濃度定量。）三、實(shí)驗(yàn)材料及方法4.AChE抑制劑對(duì)AChEIC50值的測(cè)定2.65mLPBS(pH8.0),50μL乙

5、酰膽堿酯酶(0.85U/mL),100μL15mMDTNB和樣品溶液100μL加入試管，37℃預(yù)熱2min，然后加入100μL15mM硫代乙酰膽堿（起始濃度是0.5mM），在37℃保溫20min后立即加入1mL0.4％SDS終止反應(yīng)，將所得溶液立即在412nm下測(cè)量吸光值并根據(jù)下式計(jì)算抑制率：抑制率(％)=[A對(duì)照-(A樣品-A樣品空白)]/A對(duì)照×100。按照公式計(jì)算抑制率，以橫坐標(biāo)為酶促反應(yīng)體系中抑制劑的濃度，縱坐標(biāo)為抑制率，繪制曲線，計(jì)算其抑制率為50%時(shí)的抑制劑濃度，即為IC50。三、實(shí)驗(yàn)材料及方法5.抑制劑對(duì)乙酰膽堿酯

6、酶抑制類(lèi)型的確定（1）抑制作用是否可逆在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的酶液，加入一定量抑制劑，以酶濃度為橫坐標(biāo)，以初速度為縱坐標(biāo)，繪制曲線。根據(jù)曲線形態(tài)判斷抑制作用是否可逆。（2）抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定及類(lèi)型判定以不同濃度的硫代乙酰膽堿為底物，加入一定量抑制劑或不加抑制劑，測(cè)定反應(yīng)速度。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法和Dixon作圖法，確定抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)并判斷抑制類(lèi)型。四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可逆抑制，判斷其抑制類(lèi)型。競(jìng)爭(zhēng)性抑制?or非競(jìng)爭(zhēng)性抑制?or反競(jìng)爭(zhēng)性抑制?四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析米氏方程判斷可逆不可逆四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析四、實(shí)

7、驗(yàn)數(shù)據(jù)分析四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析二、研究?jī)?nèi)容Dixon作圖法求Ki只要以[I]為橫坐標(biāo)，以1/v為縱坐標(biāo)，采用1個(gè)以上的[S]，給出不同[S]時(shí)的直線，由這些直線的交點(diǎn)即可求得Ki.四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析五、后續(xù)工作展望阿爾茨海默病(Alzheimerpsdisease,AD)又稱(chēng)早老性癡呆(preseniledementia),是發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性癡呆為特征的大腦退形性病變。老年人中AD的發(fā)病率較高。隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高和健康衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展,不少城市的人口老齡化現(xiàn)象日益嚴(yán)重,如北京、上海等地,60歲

8、以上人群中就約有5%AD患者。AD的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能減退,并伴隨行為障礙及情緒異常等,直至生活不能自理。其發(fā)病率和死亡率較高,故AD日益成為當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)面臨的最為嚴(yán)峻的問(wèn)題之一。AD病人的膽堿能系統(tǒng)受到損害導(dǎo)致突觸部位乙酰膽堿含量降低,從而使病人的學(xué)習(xí)和